胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的恶性肿瘤之一，尽管在过去的几十年里，胰腺癌(PC)的手术和辅助治疗有了很大的改进，但其5年生存率几乎没有改善。据报道，到年，PDAC将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。因此，对PDAC的分子病理学机制有待进一步深入研究。
骨形态发生蛋白(BMPs)是属于TGF-β超家族的生长因子，通过与1型和2型BMP受体结合来启动细胞内的BMP信号。BMP/BMPR介导的信号转导已在胚胎发育过程中的自我更新和干细胞维持等多个生物学过程中得到了证实。近年来，在乳腺癌和胃癌中检测到骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)的异常表达，且已证实BMPR2的异常表达参与了肿瘤细胞的增殖、分化和迁移。然而，BMPR2在PDAC中的作用及其调控机制尚不清楚。
研究路线研究内容1、BMPR2在PDAC中过表达，抑制BMPR2的表达可以抑制PC细胞的增殖
作者用免疫组化法检测了PC和正常胰腺组织中BMPR2的表达。结果表明，与正常胰腺组织相比，PDAC组织中BMPR2明显过表达。通过分析BMPR2的表达水平和临床病理特征的相关性，作者发现BMPR2的表达与肿瘤TNM分期和肿瘤大小相关，提示BMPR2可能参与了PC的生长。通过对PDAC组织中BMPR2表达水平与患者总生存的相关性分析，作者发现BMPR2表达水平越高的患者总体生存率越低，提示了BMPR2在PC患者中的预后作用。作者对多种常用的PC细胞系：BxPC-3、SW、T3M4、AsPC-1、PANC-1、MiaPaCa-2、Capan-1，以及正常胰腺导管上皮细胞系：HPNE中BMPR2的表达进行了检测。结果显示，大多数PC细胞系中BMPR2的表达量较高。作者选择了BMPR2表达最高的MiaPaCa-2和PANC-1细胞系进行下一步实验。
作者将两个shRNA序列转染入MiaPaCa-2和PANC-1细胞，并证明了两个shRNA序列均能显著下调BMPR2的表达。然后作者测量了BMPR2表达抑制后这两种细胞系的增殖能力，CCK-8结果显示，BMPR2表达下调后，细胞增殖明显受到抑制；集落形成实验表明，MiaPaCa-2和PANC-1的集落形成能力也受到抑制。通过流式细胞术检测了BMPR2表达抑制后MiaPaCa-2和PANC-1细胞的细胞周期，结果显示，BMPR2表达抑制后细胞停滞在G2/M期。作者进一步检测了2个cG2/M期相关蛋白CyclinB1和CDK1的表达，结果表明，BMPR2表达抑制后，CyclinB1和CDK1的表达明显受到抑制。这些结果证实了BMPR2在促进PC生长中起着重要作用。
2、GRB2在PDAC中表达上调，是BMPR2调控的潜在靶点
为了了解BMPR2在PC细胞增殖中的作用机制，作者采用定量的蛋白质组学分析方法比较了BMPR2表达抑制前后MiaPaCa-2细胞的蛋白质组学变化。结果表明，BMPR2的表达抑制导致了MiaPaCa-2细胞中蛋白表达的显著变化。进一步的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析表明，GRB2是BMPR2调控的潜在靶点。作者接着通过定量PCR(qPCR)和westernblot分析了GRB2在PC和配对正常胰腺组织中的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，GRB2在PDAC组织中的mRNA水平和蛋白水平明显高于癌旁。进一步的Kaplan-Meier生存分析表明，GRB2表达水平越高，总生存率越短。作者利用TCAG数据库的数据分析了BMPR2和GRB2之间的相关性。结果显示，PDAC中BMPR2和GRB2的表达水平呈正相关。下调BMPR2的表达后，作者检测了GRB2在PC细胞中的表达。结果显示，在MiaPaCa-2和PANC-1细胞中，BMPR2表达抑制后，GRB2的表达显著下调。因此，BMPR2作为一种信号转导膜蛋白，可能通过调控GRB2而发挥促进增殖的作用。
3、GRB2促进PC细胞增殖，可以逆转BMPR2表达抑制所诱导的增殖抑制
接下来，作者分析了GRB2在PC细胞增殖中的作用。CCK-8结果显示，GRB2的表达下调抑制了MiaPaCa-2和PANC-1细胞的生长。集落形成实验表明，GRB2的表达下调抑制了MiaPaCa-2和PANC-1细胞的集落形成能力。作者接下来检测了GRB2的表达下调后细胞周期的变化。流式细胞术结果显示，MiaPaCa-2和PANC-1细胞明显阻滞在G2/M期。westernblot进一步检测CyclinB1和CDK1的表达，结果显示，这2个G2/M期相关蛋白表达明显受到了抑制。这些结果表明GRB2在PC中具有促肿瘤发生作用。
作者在BMPR2表达下调的PC细胞中上调了GRB2的表达，并进行CCK-8和集落形成的检测。CCK-8结果显示，GRB2的表达上调逆转了BMPR2下调的增殖抑制作用。集落形成实验也显示了类似的结果。这些结果表明，BMPR2通过调控GRB2在PC中发挥促进增殖的作用。
4、GRB2调控PC中的PI3K/AKT信号通路
在蛋白质组学分析的基础上，作者进一步分析了BMRP2表达下调的MiaPaCa-2细胞中信号通路的变化。分析表明，最明显的变化信号通路是PI3K/AKT信号通路，G2/M检查点信号通路也有明显变化。作者通过富集分析，进一步证实了PI3K/AKT信号通路的显著变化。
为了验证这些生物信息学分析结果，作者在MiaPaCa-2和PANC-1细胞中下调了BMPR2表达，并检测了GRB2、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的表达水平；westernblot结果显示，BMPR2的表达敲除后，GRB2、p-PI3K、p-AKT和p-AKT的表达均受到抑制。为了进一步验证GRB2对PI3K/AKT的调控作用，作者将GRB2表达下调后，检测了PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT水平；结果显示p-PI3K、p-AKT和p-AKT的表达明显受到抑制。这些结果表明，BMPR2通过调控GRB2的表达，进而调控PI3K/AKT信号通路的磷酸化，促进PC细胞增殖。
5、LDN抑制PC细胞的增殖，诱导PC细胞发生G2/M阻滞
在确认BMPR2在PC中的致瘤作用后，作者使用BMPR2抑制剂：LDN来分析BMPR2的药理抑制对PC细胞的影响。结果表明，LDN显著抑制了MiaPaCa-2和PANC-1细胞的增殖，且呈浓度依赖性。作者进一步分析了LDN作用于MiaPaCa-2和PANC-1细胞后的细胞周期，结果显示，LDN在PC细胞中诱导了G2/M期阻滞，且呈浓度依赖性。作者用westernblot检测了LDN对MiaPaCa-2细胞中BMPR2和GRB2表达的抑制作用，结果表明，LDN对MiaPaCa-2细胞中BMPR2和GRB2表达的抑制作用呈浓度依赖性。这些数据表明，LDN通过抑制BMPR2，可作为一种有效的PC细胞抗增殖药物。
6、LDN通过抑制BMPR2/GRB2/PI3K/AKT轴而抑制PC的生长
为了证实LDN在体内对PC的抑制作用，作者使用了胰腺癌原位移植模型和患者源异种移植瘤(PDX)模型进行动物实验。肿瘤初发后，原位移植模型每天腹腔注射1次LDN，对照组每天注射1次生理盐水。在治疗过程中，利用体内成像系统监测各组的荧光强度，结果显示LDN显著抑制了肿瘤生长。在治疗结束时，切除原位肿瘤并拍照。作者对切除标本进行免疫组化检测，发现肿瘤中BMPR2、GRB2和Ki67表达下调。此外，westernblot分析结果显示，BMPR2、GRB2、p-PI3K和p-AKT在移植瘤中表达显著下调。这些结果表明，BMPR2的表达抑制通过抑制GRB2/PI3K/AKT通路进而抑制了PC生长。
为了进一步证实这些发现，作者在PDX模型中重复了这个实验。治疗期间测量肿瘤体积。在治疗结束时，肿瘤被切除并称重。结果表明，LDN显著抑制PDX的肿瘤生长。作者还通过westernblot检测了这些肿瘤中BMPR2、GRB2、p-PI3K和p-AKT的表达水平。与原位PC模型一致，上述蛋白水平降低。众所周知，LDN并不是BMPR2的特异性抑制剂。为了验证BMPR2的敲除可以直接导致PC生长的抑制，作者在PANC-1细胞中使用shRNA下调BMPR2，并进行了体内实验。结果显示，shBMPR2组肿瘤比对照组小得多。因此，作者证实了，PC中BMPR2的下调通过抑制GRB2/PI3K/AKT轴而抑制肿瘤生长。
研究结论作者揭示了BMPR2在PDAC中的致瘤作用，证明了BMPR2的表达抑制可通过调控GRB2/PI3K/AKT轴而抑制PDAC的生长。作者为使用BMPR2抑制剂治疗PDAC提供了证据，并指出这是一种很有前途的PDAC治疗策略。
参考文献YazhouWang,HuahuGuo,ZhengkuiZhang,QiWang,XiaodongTian,YinmoYang.Inhibitionofbonemorphogeneticproteinreceptor2suppressespancreaticductaladenocarcinomagrowthbyregulatingGRB2/PI3K/AKTaxis.AnnTranslMed;9(7):.