建立胰腺导管室疾病的体外模型需要全面了解胰腺特定细胞类型的发育轨迹。近日，德国SandraWiedenmann团队在NatureBiomedicalEngineering上发表”Single-cell-resolveddifferentiationofhumaninducedpluripotentstemcellsintopancreaticduct-likeorganoidsonamicrowellchip”介绍了在微孔芯片上从人类诱导多能干细胞（hiPSC）分化胰腺导管样类器官（PDLO）。该研究确定了从胰腺祖细胞到导管中间体再到两种成熟导管状细胞以及非导管状细胞类型的分化途径，并进行了共培养、胰腺导管癌相关生物标记等方面的探索。
胰腺导管细胞具有重要作用，其发育不良或功能障碍可能引起严重的器官恶化甚至导致胰腺导管癌（PDAC），PDAC是最致命的癌症之一。由于健康或早期病变的胰腺导管材料缺乏，目前的研究主要采用胰腺癌衍生类器官，这种类器官具有先天缺点：（1）具有不确定的遗传背景，（2）来源于肿瘤，（3）模拟癌症的终末期，（4）不适合在胰腺发育不良的早期发现生物标记物。一定程度上不利于对疾病标志物的发现和药物的研究。而目前人们对人类胚胎导管发育的知识非常缺乏，成人胰腺类器官既难以培养也不能提供发育中间产物。因此，该团队采用微孔芯片，利用人诱导多能干细胞（hiPSC）在体内建立胰腺导管的分化模型，且采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术深入分析分化过程，提供了胰腺导管体外分化轨迹的精确细胞表述，并分析了该微孔芯片可能的应用。
1.微孔芯片的设计
为了实现对从hiPSC衍生的胰腺祖细胞到导管样类器官的长期培养，团队设计了一种芯片（图1a-d）。该芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻制成，模具由3D立体光刻技术制备。每个芯片包含四个六边形微孔阵列，每个六边形微孔阵列周围有12个圆柱，可以在阵列上方保留一滴水便于组织培养。芯片底层PDMS薄至um，便于培养物的观察和高分辨率成像（图1c）。根据微孔直径、每孔初始细胞数（50，太少不利于聚集）、4小时形成聚集体平均直径（um，太大妨害营养供应），团队选择了96um的平均初始胰腺祖细胞聚集体大小（um直径孔中的个细胞）。
图1用于产生和培养3D组织的微孔芯片2.微孔芯片上的导管分化
使用微孔芯片可将3D胰腺祖细胞聚集体分化为PDLO。13d后胰腺祖细胞在芯片上形成聚集体，并在特定生长因子作用下分两步分化（图2a）。明场图像显示聚集体在微孔内发生巨大形态变化：13-20d的第一阶段中，均匀圆形的胰腺祖细胞聚集体被新形成的多层上皮凸起打破；20d之后的第二阶段中，形成多层上皮PDLO和囊性PDLO两种形态不同组织，其中多层上皮类层数减少，囊性类与PDLO外层逐渐隔离，而在31天囊性PDLO仍与多层上皮PDLO部分相连（图2b）。免疫荧光图像表明分化第一阶段结束时发生了细胞重组：标志上皮性质和导管身份的KRT19和CDH1表达上调，而祖细胞阶段已存在的标记物SOX9和PDX1保持表达状态（图2c、d）。
图2微孔芯片中的PDLO分化
为了证明芯片上衍生的PDLO具有谱系承诺性，团队将培养至27天的PDLO移植至免疫缺陷小鼠胰腺内（图3a），8周后形成了导管状组织，免疫荧光显示上皮导管标记物阳性，而内分泌细胞标记物呈阴性（图3b、c）。此外，免疫荧光显示芯片上培养的PDLO主要显示出顶端外极性，有机体内腔非常狭小（图3d），可能的解释是悬浮培养模式缺乏细胞外基质（ECM）沉积。团队尝试将芯片衍生PDLO转移到3DMatrigel中或移植后，均观察到顶端外极性向严格顶端内极性的转换（图3d）。
3.导管样类器官的单细胞表征
团队利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图4a），用UMAP进行Louvain聚类和scRNA-seq数据分析，在转录层面上根据细胞簇出现时间确定了9个细胞集群（图4b、c）：簇I-IV为4种推定的祖细胞类型，簇V-VII为3种类型的导管样细胞，簇VIII为1个小的内分泌样细胞群，簇IX为1个非胰腺细胞群（即内皮样细胞）。为测试分化方法单细胞水平上的鲁棒性，进行了两个独立实验的末期阶段测序（图4d）。
根据不同细胞簇不同标记物的转录情况分析，可以得知2D培养得到的祖细胞实际包含单能和多能两种转录谱的祖细胞，其中单能胰腺祖（UDP，簇III）13天后进入导管原发，多能胰腺祖（MPPs）可以在小鼠中产生腺癌细胞、内分泌和导管细胞；随分化进展也出现三个导管状细胞簇：导管状细胞1（簇V）表达HCO3?分泌相关蛋白如CFTR、导管状细胞2（簇VI）富含粘蛋白相关基因如MUC13和TFF1、导管状细胞3仅包含个细胞且CLDN4和MMP1的表达显著增加（图4e、f）。该实验从细胞层面精确表述了分化轨迹。
图4scRNA-seq识别胰腺祖细胞到PDLO分化的细胞异质性
4.PDLO中的导管细胞亚群
为了验证蛋白质水平上单细胞转录组学中确定的管状细胞类型，团队对芯片衍生PDLO进行了免疫荧光染色。到第23、27、31天，CFTR仅在多层上皮PDLO细胞中表达，MUC13在多层上皮PDLO外侧全部囊性PDLO中表达（图5a）。
将PDLO（图5b）、人类健康胰腺标本（图5c）、人类慢性胰腺炎标本（图5d）进行多种标志物的荧光染色对比，展示了多种导管标志物在PDLO和人类初级组织蛋白质水平的空间变化表达模式。蛋白质层面的表达状态可能比前文转录层面结果所显示的更动态、更复杂。
图5PDLO和原生胰腺组织中特异性基因在蛋白质水平的表达对比
5.体外导管发育轨迹
团队利用动态RNA速度分析研究PDLO分化过程中的时间依赖关系（图6a），实验结果与理论潜伏时间相匹配（图4a）。相应的RNA速度流线表明胰腺祖细胞向导管样细胞分化的两条途径：（1）导管样1细胞由MPP进化而来，（2）导管样2细胞主要由UDP进化而来，UDP已经存在于胰腺祖细胞阶段（图6b）。速度流线也从导管样1细胞定向到导管样2细胞，表明胰腺的可塑性程度与之前报道的相似。很少有内分泌细胞从MPP细胞群中出现。与速度分析一致，基于分区的图形抽象分析显示沿着第二导管分化路线的簇（点）之间的连通性（边）（图6c）。对细胞周期状态的评估表明，导管样细胞的成熟伴随着G2和S期细胞比例的逐渐减少（图6d）。胰腺祖细胞标记物表达随时间推移而降低，导管标记物上调（图6e）。图6f展示了根据似然分数排列的活跃表达基因在分化不同时间的表达情况。
图6转录组动力学的恢复预测导管样细胞类型的分化路径
此外，团队还注意到诸多线索显示PDLO可能会分泌可溶性ECM以及其相应的结合蛋白，而在开放的微孔芯片培养模式中，蛋白质很可能在培养基中分解，这就解释了前面芯片衍生PDLO的极性现象以及Matrigel培养或体内移植后的极性转换现象。
6.初级导管组织中的CFTR+和mucin+亚群
对微孔芯片衍生PDLO要求导管状细胞与人体组织非常相似，因此团队把来自原生人类胰腺组织的三个scRNA-seq数据集成到PDLO分化动力学中（图7a）。初始单元类型分配与组合数据集中的集群位置的比较进一步证实了集成方法（图7b）。由先前参考资料，人类初级导管细胞有两种类型：一种表达MUC1或TFF1，另一种表达CFTR。在合并数据集中中突出显示CFTR和TFF1，证实PDLO中存在着两种导管细胞亚型（图7a）。
总之，使用微孔芯片技术，可以在体外找到对应两种初级导管细胞亚型的scRNA-seq表达模式。
图7PDLO的导管状细胞与初级导管细胞对比，存在类似于CFTR+/mucin+的亚群
7.微孔芯片的应用
一方面，微孔芯片可用于研究胰腺导管和各种类型基质细胞之间的细胞-细胞通讯。利用微孔芯片上的四个流体可分离六边形阵列建立PDLOs和人胰腺星状细胞（HPASTEC）的无交叉污染共培养。与单一培养物相比，共培养物中涉及能量代谢和细胞信号传导的途径更加丰富。
另一方面，微孔芯片可以发现预测因子和/或早期胰腺癌生物标记物。团队使用无标签质谱法，将芯片升级到个PDLO（图8a）。团队用质谱法确定了种高置信度蛋白。对收集上层物的PDLO分泌物进行GO-term分析，将所有人体组织对过滤分泌物进行评分，显著富集于“胰腺、腺细胞”（图8b）。最后，团队使用分泌物和scRNA-seq数据，从导管状细胞最活跃的中特异性基因表达和过滤分泌物的种蛋白质中，分别发现了20和种胰腺癌的不良预后标记（图8c）。
图8PDLO的分泌物和转录组中潜在的PDAC生物标志物
8.Filaminb在人胰腺癌群体中的表达
FilaminB（FLNB）是已经在胰腺癌系细胞系中识别的一种标记物，但是未经过人类患者验证（图8d）。其功能的增减已经被证明与癌症的性质有关。团队通过免疫组织化学评估分离了胰腺导管癌的不同分组，并检测其FLNB表达。结果发现，正常胰腺导管上皮和一些腺体在腔体表面表现出弱阳性（芯片衍生PDLO也呈阳性），而PDAC在细胞质和整个细胞的表面表现出强阳性，这与癌细胞丧失极性有关（图8e）。同时，胰腺上皮内肿瘤（PanIN）也显现出强阳性。在半定量H分数法和临床相关方法的免疫组织化学观察中，癌症组织的H分数明显高于健康组织，而PanIN甚至更高（图8f）。值得注意的是PanIN是最相关的PDAC前提病变，虽然H分数与PDAC的预后等其他相关临床数据并无关系，但在PanIN病变中，H分数的升高却意味着更好的预后（图8g）。
为了检测FLNB作为液体活检生物标志物的可能性，团队对志愿者进行外周血的FLNB水平测量。健康志愿者与转移PDAC患者间并无显著差异，但相比高分化PDAC（3级或以上），低分化PDAC（2级或以下）的患者外周血内FLNB水平显著高于健康志愿者。这说明FLNB可能是区分PDAC分级的适合血液生物标志物。
团队采用了一种微孔芯片从hiPSC设计PDLO，并表述了其分化轨迹中的细胞异质性。其优点在于（1）细胞和材料的低消耗，（2）生成的三维聚集体的大小明确且均匀，（3）长期三维细胞培养的可能性，（4）在最小扰动下进行下游分析的样品检索，（5）建立共培养的可能性。微孔芯片衍生PDLO促进了同步人导管发育的逐步研究，相反，只有新的研究数据的补充才可能使得PDLO工程应用更加完善。微孔芯片可以作为质谱法等分析方法的中心接口工具，为未来发现早期肿瘤生物标志物提供更多解决方法。
SandraWiedenmann,MarkusBreunig,JessicaMerkle,ChristinevonToerne,TihomirGeorgiev,MichelMoussus,LucasSchulte,ThomasSeufferlein,MichaelSterr,HeikoLickert,StephanieEllenWeissinger,PeterM?ller,StefanieM.Hauck,MeikeHohwieler,AlexanderKlegerandMatthiasMeier..“Single-cell-resolveddifferentiationofhumaninducedpluripotentstemcellsintopancreaticduct-likeorganoidsonamicrowellchip”,NatureBiomedicalEngineering.