论文其他作者：王勇尹家俊尹敏王墨飞刘金钢
摘要
法尼类X受体(FXR)及其相关通路参与了袖状胃切除术治疗超重或肥胖合并糖尿病患者的过程。本研究旨在探讨胃袖状切除术治疗肥胖型糖尿病过程中FXR表达调控的机制。用链脲佐菌素和高脂饮食联合诱导建立糖尿病大鼠模型。数据收集包括体重、糖脂代谢化学指标、肝功能、袖状胃切除诱导的肌肉腱膜性纤维肉瘤癌基因家族B(MAFB)、FXR及相关基因的表达水平。通过建立高表达MAFB基因的Chang肝细胞，以证实相关基因的表达。并通过芯片和荧光素酶报告基因来检测MAFB对FXR基因的结合和激活。垂直袖状胃切除可显著减轻糖尿病大鼠体重，降低血糖和血脂，减少脂质沉积，恢复脂质功能。袖状胃切除术还恢复了糖尿病大鼠肝脏MAFB、FXR和FXR调节基因的表达。MAFB在Chang肝细胞中的过表达导致FXR基因表达激活和多个FXR调控基因的改变。芯片分析表明MAFB能直接与FXR启动子结合，荧光素酶报告基因分析证实FXR表达被激活。袖状胃切除术对糖尿病超重或肥胖患者的治疗作用是通过MAFB转录因子结合激活FXR表达介导的。
关键词：糖尿病；肥胖；袖状胃切除术；MAFB；FXR
介绍
糖尿病(DM)，是一种常见的代谢疾病，其特征是血糖水平异常升高，如果不接受治疗会导致严重的并发症，如心血管疾病、肾脏疾病、中风、足部溃疡和眼病。2型糖尿病，曾被称为非胰岛素依赖型糖尿病，是由胰岛素抵抗引起的最常见的糖尿病类型，胰岛素抵抗是指人体细胞对胰岛素不能正常反应。糖尿病患者常超重或肥胖，最近的病因学研究表明肥胖和缺乏体育锻炼是2型糖尿病的主要原因。此外，目前的一项系统回顾和mata分析证实，应该鼓励通过健康饮食模式、减少能量摄入和定期体育锻炼来控制体重，从而作为2型糖尿病肥胖患者的主要预防和治疗策略。然而，肥胖在糖尿病发展中的致病作用的具体机制以及糖尿病患者体重控制的治疗效果还不是很清楚。
袖状胃切除术(SG)已成为肥胖糖尿病患者控制体重的一种有效手术方法。一项包括27项独立研究和名糖尿病患者的大规模mata分析表明，袖状胃切除术在大多数糖尿病患者中产生了显著的糖尿病疗效和糖尿病标记物的改善。一项小鼠模型研究也观察到了类似的结果：垂直袖状胃切除术(VSG)可以降低体重，缓解脂肪肝和胰岛素抵抗。在一项使用加州大学戴维斯分校2型糖尿病大鼠的动物模型研究中，VSG不仅能有效减肥和治疗糖尿病，而且还能预防2型糖尿病的发生。然而，对介导袖状胃切除术在减肥和缓解糖尿病作用的分子机制还不明确。
法尼醇X受体(FXR)是胆汁酸的感受器和核受体，可激活FXR作为营养信号分子的活性。胆汁酸是一种两亲性洗涤剂类分子，是胆固醇分解代谢的最终产物，它可以促进胆固醇和膳食脂质的溶解，并与脂质、胆固醇和葡萄糖代谢密切相关。与FXR结合的胆汁酸诱导成纤维细胞生长因子15/19的表达，以调节胆汁酸的合成、糖原代谢和胆囊充盈。与FXR在新陈代谢中的关键作用一致，FXR已被证明与肥胖相关的糖尿病有关。例如，通过激动剂治疗增强FXR活性或FXR基因过表达导致正常和糖尿病小鼠的血糖水平显著降低，证实了FXR在葡萄糖代谢调节中的关键作用。值得一提的是，FXR激动剂已经被成功地用作治疗糖尿病和其他非酒精性脂肪性肝病的药物。更重要的是，VSG的治疗价值被发现是由FXR信号介导的，从而导致糖尿病小鼠体重减轻和糖耐量改善。然而，FXR在袖状胃切除术糖尿病治疗过程中的调节机制值得进一步研究。
在这项研究中，利用肥胖糖尿病大鼠模型分析了VSG对体重、血糖和脂质含量的影响，以及对肝功能的影响。为了探讨VSG有效诱导体重减轻和糖尿病症状缓解的分子机制，我们通过Jaspar生物信息学分析，预测肌肉腱膜性纤维肉瘤癌基因家族B(MAFB)是可能与FXR启动子结合的候选转录因子之一。先前的研究表明，MAFB是胰岛α细胞活性和β细胞成熟的关键调节因子。在此，我们研究了SG对MAFB表达的影响，MAFB对FXR表达的调控，以及下游的调控机制，为探讨袖状胃切除术治疗肥胖型糖尿病的作用机制提供了新的思路。
材料和方法
饮食与动物模型
将8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠单独饲养在医院动物饲养中心的铁丝笼中，维持14h光照10h黑暗周期。肥胖糖尿病大鼠采用高脂饮食(中国广东省医学实验动物中心)和链脲佐菌素(STZ)相结合的方法建立。简而言之，先用高脂饮食喂养大鼠12周，然后单次腹腔注射65毫克/公斤的链脲佐菌素(STZ)。注射STZ3天后，用血糖仪(iChem，库贝尔公司，中国)分析STZ处理后的大鼠尾部静脉血中的葡萄糖含量。以血糖水平16.7mmol/L、体重g为肥胖糖尿病大鼠的定义，以喂饲正常脂肪饲料(广东省医学实验动物中心)、并给予单次腹腔注射水的大鼠为对照。一周后，分别对肥胖糖尿病大鼠实施VSG或假手术。本研究的实验方案经医院伦理委员会批准。本研究中的大鼠如图1A所示分为三组：正常对照组(CON)、糖尿病大鼠假手术组(Sham)和糖尿病大鼠袖状胃切除术(SG)组，如图1A所示：正常大鼠喂饲正常脂肪饲料并注射水和假手术，假手术组大鼠接受假手术。
垂直袖状胃切除术与假手术
在糖尿病大鼠上实施VSG手术。简而言之，大鼠在VSG和假手术前连续3天喂流食。大约3-5%的异氟醚用于手术大鼠的麻醉诱导和维持。首先做一个大约3厘米的腹部正中切口，然后横切附着在大鼠肝和脾上的结缔组织，这样就可以隔离胃了。包含整个胃底大约70%的胃被切除，剩下的管状残留物连接食道和幽门。经适当洗胃后，将残胃置入腹腔。最后，关闭腹腔。手术组大鼠术后给予恩诺沙星(20mg/kg)和美洛昔康(2mg/kg)联合用药，连续14天。Sham组接受了与前面描述的类似的VSG，但在缝合大约3厘米的腹部切口之前没有切除任何东西。
生化生理指标测定
如前所述，对糖尿病大鼠和对照组的主要生化和生理指标进行了测量。采用日本日立公司生产的全自动生化分析仪测定空腹血糖(FBG)、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，并与正常对照组比较，观察各组大鼠空腹血糖(FBG)、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的变化。空腹胰岛素(FINS)水平用胰岛素放射免疫分析(RIA)试剂盒(北京原子高科公司)，测定使用自动放射免疫分析仪(西安核仪器厂，中国)。
图1、袖状胃切除术(SG)、假手术(Sham)和对照组(CON)的A、实验方案和B、体重。采用高脂饮食(HFD)联合链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型。对糖尿病大鼠进行SG和假手术。以正常脂肪饲料(NFD)喂养的假手术大鼠为对照。C为空腹血糖(FBG)；D为空腹胰岛素(FINS)；E为游离脂肪酸(FFA)；F为总胆固醇(TC)；G为甘油三酯(TG)。数据以均值±标准差(Means±SD)形式报告。P0.05，P0.01(t检验)。
油红-O染色法分析脂质沉积
VSG或假手术糖尿病大鼠和对照组的肝脏切片中脂质沉积的组织学观察使用油红-O(脂质染色)试剂盒(#ab；abcam，UK),操作按照制造商的说明进行。简而言之，大鼠肝脏切片先在丙二醇中孵育2min，然后在油红O溶液中孵育6min，然后在85%丙二醇中孵育1min。用蒸馏水冲洗2min后，用苏木素在37°C孵育2min，再用自来水和蒸馏水冲洗，最后在盖玻片下用水溶性封片剂固定。将大鼠肝组织中沉积的脂质染成红色，在显微镜下观察。
定量RT-PCR和Westernblotting
提取总RNA，采用定量RT-PCR方法(qRT-PCR)分析相关基因在大鼠肝脏和Chang肝细胞中的相对mRNA水平。简单地说，根据制造商的说明，用Trizol溶液(SigmaAldrich，美国)提取大鼠肝组织或Chang肝细胞的总RNA样本。使用EasyScriptFirst-StrandcDNA合成SuperMix试剂盒(TransgenBiotech，China)，用约2ugRNA进行cDNA合成。定量RT-PCR的方法是将2mLcDNA和1mL特异引物与TransStarttSYBRGreenqPCRSuperMix(TransgenBiotech)混合。以磷酸甘油醛脱氢酶为内对照进行基因表达定量。用抗MAFB(#ab，Abcam，UK)和抗FXR(#AB，MerckMillipol，Germany)抗体，用免疫印迹法检测MAFB和FXR在大鼠肝组织和Chang肝细胞中的相对蛋白丰度。
细胞培养和转化
人肝细胞Chang肝细胞购自中国科学院细胞库，在含10%胎牛血清、链霉素mg/mL、青霉素U/mL的DMEM培养基中37°C培养，湿度95%，二氧化碳浓度5%。高表达MAFB基因的Chang肝细胞的建立是按照前面描述的方法完成的，只需稍加修改。简单地说，如参考文献所述将人MAFB基因ORF克隆到pcDNA3.0表达载体中。为了过表达MAFB基因，将MAFB-pcDNA3.0载体接种于培养皿中，使用Lipofectamine试剂(Invitgen，美国)转染MAFB-pcDNA3.0。用pcDNA3.0质粒作为对照质粒DNA，按照厂家推荐的方法使用Lipofectamine试剂转染。转染48h后，用实时PCR和Westernblotting检测表达水平。
染色质免疫沉淀(CHIP)
MAFB与FXR启动子的结合用染色质免疫沉淀(CHIP)检测，使用CHIP试剂盒(#ab，Abcam)，按照制造商的说明进行操作。Anti-MafAantibodyChIPGrade试剂(#ab，Abcam)用于免疫沉淀。最后通过PCR扩增启动子序列确定其结合情况。以IgG抗体作为阴性对照。
荧光素酶报告基因转录活性测定
通过基于荧光素酶的报告分析参照前面描述的方案，遵循制造商的说明使用pGL3启动子载体(#E，Promega)，证实MAFB激活了FXR的表达。将野生型FXR启动子和预测结合位点突变的突变型FXR启动子分别克隆到pGL3启动子载体中。FXR启动子的正向和反向引物与Table1相同。购自中国科学院细胞库的HEK细胞在含10%胎牛血清的DMEM中培养，温度37℃，湿度95%，CO2浓度5%。PGL3启动子载体转染HEK细胞的实验研究野生型或突变型FXR启动子是根据制造商的说明使用FugeneHD转染试剂(美国罗氏)进行的。转染后48h用被动裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。荧光素酶活性与载体对照相比呈倍数变化。
统计分析
使用SPSS软件包(版本18.0，SPSS)进行统计分析。通过使用至少三个生物重复数据的学生t检验，对差异的显著性进行了统计检验。显著性差异由P值0.05定义。
结果
VSG诱导糖尿病大鼠体重减轻并降低血糖和血脂
从研究开始每周测量大鼠的体重，结果显示，与对照组相比，Sham组和SG组在手术前高脂饮食导致体重显著增加。胃袖状切除术显著降低了SG组糖尿病大鼠的体重(图1A)。与体重变化相一致的是，血糖和血脂分析还显示，与Sham组相比，SG组的FBG、FINS、FFA、TC和TG显著降低(图1B-G)，表明VSG通过改善糖脂代谢而有效地减肥和缓解糖尿病。
VSG改善糖尿病大鼠肝功能的实验研究
与对照组相比，假手术组两种常见肝功能指标AST和ALT水平显著升高，但VSG有效地恢复了AST和ALT水平(图2A和B)。油红O染色结果显示，与对照组相比，STZ诱导的糖尿病大鼠肝组织中脂肪沉积明显增加，但袖状胃切除显著抑制了糖尿病大鼠肝组织中的脂肪沉积(图2C)。结果表明，袖状胃切除术能有效恢复糖尿病大鼠的肝功能，说明肝脏在手术治疗糖尿病过程中起着重要的调节作用。
用VSG恢复MAFB和FXR的表达
为了探讨VSG生理效应的分子机制，预测了调节胰岛α细胞活性和β细胞成熟的MAFB蛋白可能是FXR表达的调节因子(数据未示出)。结果表明，假手术糖尿病大鼠肝组织中MAFB和FXR的mRNA水平均显著降低，但VSG使MAFB和FXR的mRNA水平恢复到与对照组相当的程度(图3A和B)。糖尿病大鼠肝脏中MAFB和FXR蛋白丰度的下降也被VSG恢复(图3C)。糖尿病大鼠MAFB和FXR的表达变化与糖代谢和肝功能密切相关，提示这两种蛋白可能是袖状胃切除治疗糖尿病的关键分子。
袖状胃切除术对FXR调节信号成分的调节
为了进一步研究FXR在VSG调节的糖代谢和糖尿病进展中的作用，我们还用定量RT-PCR方法检测了FXR调控的6个关键信号成分在VSG诱导的糖尿病大鼠肝脏中的表达水平。糖尿病大鼠小分子异源二聚体1(SHP-1)的mRNA水平显著降低，但经VSG治疗后恢复(图4A)。相反，糖尿病大鼠肝脏中甾醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)的表达与对照组相比显著增加，但被VSG显著抑制(图4B)。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的表达水平在这些组中表现出与SHP-1相同的变化(图4C)。与对照组相比，假手术组和SG组糖尿病大鼠肝组织胆固醇7α-羟化酶基因(CYP7A1)的表达也发生了相关变化(图4D)。此外，我们的结果显示糖尿病大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达受到假手术和VSG的相反影响(图4E)。葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)在本实验中未见明显变化(图4F)。这些FXR调控基因的显著相关表达变化提供了多条线索，表明FXR在VSG治疗DM过程中具有很强的调控功能。
MAFB调控的FXR相关信号级联过表达
为探讨MAFB在调节FXR表达和下游信号级联中的作用，将含有MAFB开放阅读框架(ORF)的pcDNA3.0质粒瞬时转染Chang肝细胞，并以原载体pcDNA3.0为对照。定量RT-PCR和Westernblotting均证实MAFB在Chang肝细胞中过表达(图5A和图C)。更重要的是，MAFB在Chang肝细胞中的过表达也大大增强了FXR的表达，显示MAFB对FXR表达的直接激活作用(图5B和C)。为了进一步探讨MAFB在诱导FXR表达中的作用，我们还分析了图4D至I所示的这四个FXR调控基因，以及G6Pase和PPARa。结果表明，MAFB过表达显著改变了SHP、G6Pase、PPARa、SREBP、PEPCK和CYP7A1的表达。这些细胞很明显表明MAFB调节人肝细胞FXR及相关分子过程中具有很强的能力。
图2.袖状胃切除术改善了糖尿病大鼠的肝功能。A和B：袖状胃切除术(SG)、假手术(Sham)和对照组(CON)大鼠的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。C：SG糖尿病大鼠肝组织脂质沉积。组织用油红-O法染色为红色。数据以均值±标准差(Means±SD)形式报告。P0.01(t检验)。
MAFB与FXR启动子结合诱导FXR表达
芯片检测后的RT-PCR扩增表明MAFB蛋白与HEK细胞中的FXR启动子直接相关(图6A)。为了研究MAFB结合对FXR表达的激活能力，还在HEK细胞中进行了荧光素酶报告基因的检测，结果表明MAFB与FXR启动子结合后，荧光素酶基因被显著激活，而突变体对报告基因的表达没有明显的激活作用。这些结果清楚地表明MAFB是通过直接结合FXR基因启动子而激活FXR表达的关键转录因子。
讨论
糖尿病是一种以糖代谢紊乱为特征的严重代谢性疾病，以往的研究表明糖尿病与肥胖有很强的相关性。虽然像VSG这样的外科手术控制体重已经被证明是治疗糖尿病合并严重肥胖症的有效方法，但这种方法背后的分子机制仍然知之甚少。如上所述，FXR被证明是一个重要的调节者可通过调节糖脂代谢调节糖尿病的发生发展，并参与VSG的治疗作用。然而，对于FXR基因在糖尿病进展过程中的表达调控，尤其是与糖尿病相关的FXR基因表达激活的转录因子的研究还不是很深入。生物信息学分析表明，MAFB基因是一种潜在的调控FXR基因表达的转录因子。在本研究中，我们发现了在接受VSG治疗的糖尿病大鼠中，MAFB的表达与FXR及多个FXR调节基因的表达密切相关。
MAFB基因在Chang肝细胞中的过表达进一步证实了MAFB对FXR表达的增强作用。这种调节得到了FXR调控的下游基因表达的支持，包括FXR诱导的参与胆汁酸生物合成的核受体SHP-1，与脂质代谢相关并受FXR负调控的SREBP-1，控制SREBP活性和脂质合成的PPARa，作为另一种重要的胆汁酸代谢调节因子的CYP7A1，以及PEPCK，其中PEPCK是FXR和SHP共同抑制的胆汁酸代谢的另一个重要调节因子。G6Pase是肝糖异生的调节因子，我们注意到其在大鼠肝脏中的表达没有明显变化，如图4F所示，这可能是由于多种代谢调节剂的功能丰富或G6Pase同工酶的特异性表达和功能所致。此外，通过芯片分析和基于荧光素酶的报告基因分析，我们发现FXR表达的激活是通过MAFB与FXR启动子的直接结合介导的。这些结果通过MAFB转录因子的活性，揭示了FXR介导的DM发生和袖状胃切除术治疗DM的新机制。结合FXR在胆汁酸、糖原和脂质代谢中的作用，这些发现表明手术导致了FXR表达的变化，下游信号的激活，以及代谢适应。这一发现为深入研究糖尿病的分子发病机制以及袖状胃切除术的治疗效果提供了重要的理论依据。
MAFB蛋白作为一种含有碱性亮氨酸拉链的转录因子，首次被鉴定为DNA结合的ETS-1蛋白的相互作用伙伴，并参与了红系分化。进一步的研究表明MAFB在多种生物学和病理过程中发挥作用，如单核细胞分化、破骨细胞分化、分化的功能性巨噬细胞的自我更新、造血干细胞的髓样分裂、呼吸节律的发生和致死性中枢性呼吸暂停。更重要的是，MAFB后来被发现是胰腺a细胞活性和b细胞成熟的有效调节剂。例如，MAFB被证明可以调节特定细胞类型的胰高血糖素基因表达，并与胰岛细胞发育和肥胖有关。最近的一项使用小鼠模型的研究报告说，造血细胞中MafB的缺乏可能会导致身体脂肪比例的大幅增加，从而加速肥胖的发展。考虑到肥胖相关糖尿病中胰岛β细胞衰竭的密切关联，预测MAFB参与糖尿病的发生是合理的，因为β细胞对胰岛素抵抗有补偿作用。不足为奇的是，MAFB被发现通过调节多种途径，包括抗氧化酶和Notch途径，对糖尿病肾病具有保护作用。本研究发现MAFBs调控的靶基因表达与糖尿病的发生、治疗有直接联系，为深入了解糖尿病发病机制和开发新的治疗方法奠定了重要的研究基础。值得注意的是，MAFB作为一种转录因子，除了FXR外，还可能调控多个基因的表达，提示对其下游调控途径的深入研究可以拓宽我们对DM发生发展的理解。考虑到MAFB和FXR在代谢中的多种功能，MAFB调控FXR表达在其他代谢性疾病中的可能参与值得进一步研究。
此外，应用高脂饮食诱导的糖尿病大鼠或小鼠模型和STZ(一种破坏胰岛β细胞的抗生素)已被认为是测试VSG对糖尿病患者的临床疗效和潜在机制的一种可行的方法。小鼠和大鼠均对STZ诱导的胰腺β细胞毒作用敏感，但大鼠因其体型而更适合外科手术，因此本研究采用了STZ治疗大鼠胰腺β细胞的方法。通过严格遵循公认的治疗方案，我们成功地建立了肥胖的DM大鼠模型，并通过VSG后体重、糖脂代谢和肝功能相关的一系列生理指标的变化证实了这一点。该模型的建立为糖尿病合并肥胖的机制研究提供了基础，证实了该模型在肥胖糖尿病研究中的适用性。
综上所述，我们认为了MAFB作为一种新的转录因子，在袖状胃切除诱导的DM消退过程中负责激活FXR的表达和下游途径。通过在糖尿病大鼠肝脏和Chang肝细胞中的表达分析，结合结合和荧光素酶报告基因检测，证实了MAFB对FXR表达的转录因子活性。这一发现为深入了解糖尿病发生的分子过程以及袖状胃切除术的治疗效果提供了有意义的见解。
图3.定量RT-PCR检测袖状胃切除术(SG)、假手术(Sham)和对照组(CON)大鼠的A，MAFB和B，FXRmRNA水平。C：Westernblotting检测MAFB和FXR蛋白水平。采用GAPDH作为内控。MAFB：肌肉腱膜性纤维肉瘤癌基因家族A；FXR：法尼醇X受体；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。数据以均值±标准差(Means±SD)形式报告。*Po0.05和**Po0.01(t检验)。
图4.定量RT-PCR分析了六种FXR调节基因SHP(A)、SREBP(B)、PPAR(C)、CYP7A1(D)、PEPCK(E)和G6pase(F)在接受袖状胃切除术(SG)或假手术的糖尿病大鼠肝脏中的mRNA表达水平，这些基因分别为SHP(A)、SREBP(B)、PPAR(C)、CYP7A1(D)、PEPCK(E)和G6pase(F)。定量RT-PCR分析采用GAPDH作为内对照。CON：对照组；SHP-1：小二聚体伙伴1；SREBP-1：甾醇调节元件结合蛋白-1；PPARa：过氧化物酶体增殖物激活受体a；CYP7A1：胆固醇7a-羟化酶基因(CYP7A1)；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；G6Pase：葡萄糖-6-磷酸酶。数据以均值±标准差(Means±SD)形式报告。**Po0.01(t检验)。
图5.定量RT-PCR和Westernblotting分析MAFB(A)和FXR(B)在高表达MAFB基因的常肝细胞(Over-MAFB)中的mRNA水平。定量RT-PCR检测SHP(D)、G6Pase(E)、PPARa(F)、SREBP(G)、PEPCK(H)和CYP7A1(I)的mRNA水平。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)以GAPDH为内对照。CON：对照组；FXR：法尼类X受体；SHP：小异二聚体伙伴；SREBP-1：甾醇调节元件结合蛋白-1；CYP7A1：胆固醇7a-羟化酶基因(CYP7A1)；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；G6Pase：葡萄糖-6-磷酸酶；PPARa：过氧化物酶体增殖物激活受体a。**Po0.01(t检验)。
图6.A，用抗MAFB蛋白的抗体进行芯片分析MAFB与FXR启动子的结合(左)，统计分析基于三个生物重复的数据(右)。以IgG作为阴性对照。用荧光素酶报告基因检测MAFB结合激活FXR基因的表达。荧光素酶报告试验示意图。MAFB：肌肉腱膜性纤维肉瘤癌基因家族。WT：野生型；MUT：突变型；FXR：法尼醇X受体。数据以均值±标准差(Means±SD)形式报告。**Po0.01，*Po0.(t检验)
鸣谢
本研究由中国医院资助。
作者丨徐键
翻译丨谢淑丹
排版丨李林
校对丨计沈林
主编丨吴惧
人来人往岁月悠长还好有你陪我在看
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