miRNAs是在血清和其他体液中被发现的一种重要的疾病生物标志物。其中分泌型miRNAs，特别是细胞外囊泡(EVs)中如外泌体分泌的miRNAs，可能参与介导不同组织间的旁分泌和内分泌通讯，来调节基因表达和远程调控细胞的功能。当其受损时，会导致组织功能障碍、衰老以及疾病的发生。脂肪组织是循环外泌体miRNAs池的重要来源，各种代谢条件下脂肪组织质量或功能的改变会导致循环miRNA的改变，进而导致机体一系列功能的改变。这篇综述回顾了相关研究结果，并讨论了如何为“细胞外miRNA被认为是细胞间通讯的重要介体和疾病治疗的潜在候选者”这项新的研究奠定基础。
一、引言
MicroRNAs(miRNAs)是由体内各种细胞产生的约22个nt的调节性非编码小RNA。尽管它们的多样性、数量与生物的复杂性相关，许多miRNA在进化过程中高度保守。秀丽隐杆线虫的曲目包含个miRNAs，小鼠超过个，而人类产生到个miRNAs。大部分miRNAs广泛表达，部分也具有组织特异性表达的特点。这种分布模式是由细胞内miRNA前体的转录和转录后调控所驱动的。
miRNAs的合成过程包括很多步骤。在细胞核中，初级miRNAs(pri-miRNAs)被RNA聚合酶II转录，然后由微处理器复合体(内含核糖核酸内切酶DROSHA及其RNAbindingDGCR8)或者剪接机制的组件处理。这导致大约70nt的pre-miRNAs，通过XPO5和RanGTPase输出到细胞质中。pre-miRNAs在III型核糖核酸内切酶DICER和RNA结合蛋白TRBP与PACT共同处理下产生双链miRNAduplex。这些miRNAduplex被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，其中Argonaute-2(AGO2)和HSC70/HSP90等分子伴侣介导miRNA双链中的一条链与其靶mRNA的相互作用，从而抑制mRNA的翻译或加速mRNA的降解。小部分miRNA可通过非典型途径发挥作用，产生相反的效果，诱导转录和上调蛋白表达。同时也有报道miRNA合成不依赖DICER的途径，但它们对miRNA合成的影响有限。与mRNAs相似，miRNA表达谱也可作为细胞标志物。例如，肝脏中miR-高表达，占该组织中表达的总miRNA的70%。肌肉细胞中富含miR-1、miR-a、miR-b、miR-、miR-a、miR-b、miR-和miR-，这些miRNA被称为myomiRs。miR-9和miR-几乎只在大脑中表达，后者在该组织中占近50%的miRNA含量。β细胞是唯一的高丰度表达miR-的细胞。另一方面，脂肪细胞和干细胞，则表达广泛的miRNAs。
二、miRNAs比预期的更具流动性
为了进一步探究特定细胞类型中表达的miRNAs是如何促进组织的发育和稳态，在构建了DICER或DGCR8敲除小鼠中，我们发现中枢神经系统、胰腺、骨骼和心肌的DICER敲除使小鼠无法存活或有严重的发育缺陷。而肝脏特异性DICER基因敲除小鼠(LDicerKO)、脂肪细胞特异性DICER基因敲除小鼠(ADicerKO)或DGCR8基因敲除小鼠(ADgcr8KO)在表现出代谢功能障碍的迹象之前，都无法与野生型的同龄小鼠区分，包括LDicerKO小鼠肝脂肪变性和早发性肝癌，以及ADicerKO和ADgcr8KO小鼠脂肪营养不良和胰岛素抵抗。
许多表型是因为miRNAs生成受阻改变mRNA半衰期和细胞的翻译功能，但是有一些表型因为其他组织中基因表达和功能的变化引起的二级改变，提示细胞存在miRNAs损失的非自主机制。例如，脂肪特异性DICER敲除小鼠的肝脏基因表达发生变化，当小鼠移植到正常脂肪组织时变化被逆转，表明这些变化是由脂肪组织分泌的miRNAs控制。在肝细胞中敲除DICER后，肝脏中检测到的几百个miRNAs中只有45个下调，可能的原因是每个细胞的miRNAs是内源miRNAs的产生和外源性miRNA的摄取之和。虽然肝细胞中miRNAs的减少可能被肝脏中其他细胞miRNAs的存在所掩盖，但这种可能性比较小。DICER敲除后组织中miRNA表达的相对温和的变化提示miRNA可能存在移动特性，要证实这一假设，则需利用相关技术来追踪体内miRNA的起源、运输及命运。
三、细胞外miRNA的分泌与运输
miRNAs可以通过囊泡运输和蛋白载体等被细胞输入和输出，表明miRNAs在细胞和组织间通信中的具有潜在作用。这一概念最早是由Valadi等人在年提出的，他们在不同细胞系分泌的胞外囊泡(EVs)中识别出大量的mRNAs和miRNAs，这些囊泡可以被靶吸收，然后将mRNAs和miRNAs释放到靶细胞中，同时有研究表明，体液中存在miRNAs，且水平与疾病进展相关。细胞外miRNA转运机制被广泛研究，目前已知主要有两种途径:（1）EVs的主动转运；（2）作为蛋白质-miRNA复合物的一部分转运。
3.1通过细胞外囊泡运输
通常，多泡小体(MVBs)与质膜融合产生的较小EVs(nm)称为外泌体(图1)，而由质膜直接向外出芽和裂变形成的较大EVs(nm)称为微囊泡。直接出芽产生小的囊泡外泌体，其中包括肠泌体囊泡或外泌体。
图1miRNA介导细胞间通信
RNAPII，RNA聚合酶II；RISC，RNA诱导沉默复合物；EVS，细胞外小泡。
外泌体是MVBs从核周细胞质转移到质膜后分泌的，随后融合并通过胞吐作用释放其内容物。一些小的GTPase蛋白(如Ral1、Rab27a和Rab27b)和神经酰胺生物发生相关的蛋白(如nSMase2)参与控制细胞内MVBs的形成、融合和释放。有研究发现代谢综合征神经酰胺代谢的改变，但神经酰胺代谢的改变与外泌体形成和释放的改变是否有关尚未被研究，EVs中表达的miRNAs种类和数量是由什么控制的问题至今仍知之甚少。越来越多的证据表明EVs的miRNA表达谱不同于亲本细胞，表明miRNA主动装载或分类到这些小泡中。也有研究表明AGO2等RNA结合蛋白在调控miRNA装载到外泌体中发挥作用，在MVB形成过程中，AGO2与外泌体蛋白CD63在细胞质中共定位，AGO2磷酸化导致miRNAs从复合物中解耦，改变miRNA的分类和装载，以及外泌体的释放。其他RNA结合蛋白如hnRNPA2B和Y-boxprotein1也可能赋予外泌体装载miRNA的特异性。这表明miRNA发挥作用与外泌体的负载相结合，并且与外泌体的存在不同组织中有很大差异。
同样的，外泌体和其他EVs是如何被靶细胞吸收的？这个问题目前也不是很清楚。当静脉注射时，EVs在循环中的半衰期从小至2分钟到大至60分钟，这意味着循环miRNA池中存在较大的动态范围。EVs摄取的第一步是附着在靶细胞，可能通过四聚蛋白跨膜蛋白家族成员(如CD9、CD53、CD63、CD81和CD82)、抗原识别复合体(如MHC-I和MHC-II复合物)或其他表面受体。结合后的EVs可通过三种途径进入细胞：(1)激活细胞内信号通路；(2)通过膜融合将其内容物释放到细胞内；(3)通过吞噬、大胞饮或受体介导的内吞作用。内化之后，EVs携带的各种分子可能被释放到细胞质中，被送到溶酶体中破坏，或者靶向运输到细胞内的特定位置，引发特定功能反应。EVs摄取过程表现出一定的选择性，但这些机制如何适用于不同的囊泡和宿主细胞可能不同。
3.2通过蛋白质-miRNA复合物转运
除了EVs外，miRNAs还可与蛋白质复合在血液中运输。这些复合物也可以进入细胞并传递miRNAs进而抑制靶mRNA。低密度(LDL)和高密度(HDL)脂蛋白都可以在循环中运输miRNA。在HDLs的情况下，结合的miRNAs可通过B类I型清道夫受体携带并在细胞内释放，它们可能在细胞内调节受体细胞中的基因表达。在与脂蛋白相关的miRNA中，营养和代谢状态的改变，如高胆固醇血症，可能会改变特定miRNA复合物的相对丰度。重要的是，与HDLs结合的miRNA的表达机制与EVs中发现的不同，提示两者具有互补且独立的miRNA转运机制。
尽管EVs相关和脂蛋白结合miRNAs在功能上很重要，但它们只是循环中发现的所有miRNAs中的一小部分。在一些研究中，人类血清中发现的超过一半的miRNAs可能与核糖核蛋白结合，包括argonaute(AGO2),但只有其中一小部分是完全通过这种方式进行的。核仁蛋白nucleophosmin1(NPM1)也被发现携带并保护细胞外miRNAs免于降解。AGO2或NPM1结合的miRNAs是否能在远端细胞中起改变功能的作用，或主要是miRNA处理和细胞死亡的产物，仍存在争议。Prudhomme等人证明了AGO2miRNA复合物在细胞内的内化，并发现一旦进入细胞，这些miRNA可能参与调节mRNA水平。另一种可能是RNA结合蛋白，如AGO2和NPM1携带miRNAs到细胞外并促进其装载到脂蛋白上。因此，AGO2参与了外泌体的装载，并可能与EV中的miRNAs结合。
无论其形式如何，血液和其他细胞外液中miRNAs的存在产生了两个重要的研究途径。一个是细胞外miRNAs作为疾病生物标志物的潜力，另一个是细胞外miRNAs作为细胞间通讯新模式的潜力，即细胞外miRNAs调节基因表达。作者将在下面讨论这两个方面。
四、作为疾病生物标志物
生物标志物是一种可用于疾病检测或预后预测的分子。一个好的生物标志物具有特异性、敏感性和稳定性和非侵入性等重要特征。细胞外的miRNAs可免受核糖核酸酶的保护而稳定存在，并且可以在血液、尿液或其他体液中使用简单、灵敏和相对便宜的检测方法即可检测，因此，大多数研究都将细胞外miRNAs作为潜在的生物标志物。体内miRNAs水平的变化与多种疾病相关，包括2型糖尿病(T2D)、肥胖、心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。也有研究表明细胞外miRNAs可作为个体生理状态的循环指标和精确医学中靶向治疗的工具。
4.1细胞外miRNAs的分离和检测方法
细胞外miRNAs检测方法有qRT-PCR、微阵列或RNA测序(RNA-seq)等。qRT-PCR更灵敏，不受序列丰度偏差的限制，但该技术需要优化，如适当的标准曲线，理想的情况下包括加标外源性miRNAs。微阵列和RNA-seq允许同时检测多个微小核糖核酸，为检测新的组合生物标志物开辟了可能性。
当涉及到评估细胞外miRNA的敏感性和特异性时，液体的标准化和分离中使用的分离方法是关键变量。大多数研究使用分离的EVs来避免细胞裂解产物的影响，在一个汇总了1,份出版物的数据库中，使用了超过1,种不同的方法从生物液体中检索。这些因素包括超离合和大分子试剂的使用，从而导致大范围纯度、囊泡类型的不同组合以及miRNA-蛋白复合物的“污染”。此外，在大多数研究中，囊泡制备的纯度没有确定。由于这些原因，当提到这些不同的囊泡制剂时，谨慎地使用更一般的术语“细胞外囊泡”或“EV”，而不是“外泌体”或“微囊泡”。除了分离方法的差异之外，评估miRNAs的方法的差异以及研究人群的差异以及其他因素都可能导致结果的差异性。通过研究检测，有越来越多的证据表明细胞外miRNA的变化与不同的疾病状态有关，以及与病理生理的联系(见下文；表1)。
表1循环miRNA与代谢和年龄相关疾病的关系
4.2疾病相关细胞外miRNAs
已有研究发现在肥胖患者或肥胖动物中有多种miRNAs发生改变，包括miR、miR--3p、miR-、miR-和miR-a上调，miR-和miR-下调。这些变化伴随着肥胖或肠道病毒水平的增加，部分是通过脂肪细胞分泌的EVs增加。脂肪组织被认为起着重要作用。肥胖和脂肪营养不良的脂肪细胞中多种miRNAs及其靶基因的表达水平发生改变，可能反映在细胞外miRNAs的变化上。例如，miR-是脂肪细胞中胰岛素敏感性的负调节因子，降低ERa表达和GLUT4介导的葡萄糖摄取，并导致肝细胞中的胰岛素抵抗。在肥胖症中，血液中miR-水平增加，在血液中，这种miRNAs存在于肠道病毒中，同时与高密度脂蛋白有关。
除了与肥胖相关的miRNAs，许多细胞外miRNAs也与T2D相关(表1)，包括miR-、miR-和miR-。miR-在胰岛中高度富集，它通过靶向一种参与含胰岛素颗粒与质膜融合的蛋白质肌营养蛋白(MTPN)和和胰岛素代谢信号通路中的关键分子3-磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)，抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。而且miR-参与β细胞分化和胰岛发育。有研究发现，糖尿病患者miR-血液水平升高，虽然这些报告仅分析了全血浆或血清，但miR-被认为同时存在于EVs中，并与高密度脂蛋白有关。
与健康对照组相比，患者血液中的miR-减少，MiR-可作为的生物标志物。诊断疾病前10年在个体中miR-减少，在肥胖患者中也减少。miR-的这种减少被认为有助于在肥胖中观察到的脂肪组织炎症的增加，因为miR-可以通过靶向炎症体的成分NLRP3(Nod样受体含嘧啶结构域3)和M1样巨噬细胞活化的成分IL-1b的产生来抑制炎症。miR-下调能够控制巨噬细胞分化，启动巨噬细胞对促炎刺激的反应，并导致样巨噬细胞极化。因此，miR-敲除小鼠表现出严重的胰岛素抵抗和脂肪组织炎症。
糖尿病前期和患者血清中miR-水平降低，而其在糖尿病肾脏和视网膜内皮细胞中上调。miRNAs对炎症敏感是由于肥胖小鼠的脂肪组织巨噬细胞或LPS诱导的巨噬细胞或用来自促炎巨噬细胞的条件培养基处理的脂肪细胞具有高水平miR-。事实上，miR-可以从脂肪组织巨噬细胞释放到EVs中，并转移到其他细胞类型，如脂肪细胞、肌管或肝细胞，恶化胰岛素抵抗。
心血管疾病和代谢综合征。一些与T2D和肥胖相关的微小核糖核酸也与心血管疾病有关，心血管疾病是老年人和代谢综合征患者发病率和死亡率的主要原因。因此，在动脉粥样硬化患者的血液中miR-92a、miR-和miR-减少，而miR-21、miR-、miR-a、miR-和miR-升高。另一种与胆固醇体内平衡相关的miR-。除了在脂肪组织炎症中的功能，这种miRNA还参与胆固醇合成和摄取的调节。含miR-的EVs通过抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移而穿透血管壁并减少斑块大小。患有动脉粥样硬化的小鼠和人类的miR-升高，可能作为一种补偿机制，以减少胆固醇水平和斑块大小。miR-与其他miRNAs结合，可以预测心血管事件和死亡率的风险。miR-30c与人类胆固醇水平和斑块发展呈负相关。从机理上讲，miR-30c已被证明可通过抑制微粒体甘油三酯转移蛋白MTP来减轻小鼠炎症和降低高脂血症。
冠状动脉疾病的形成也与miRNAs有关。这些变化包括miR-、miR-17、miR-92a、miR-和miR-水平降低，miR-a、miR-a和miR-a水平升高。与AGO2结合的miR-调节平滑肌基因表达，并促进平滑肌细胞的促动脉粥样硬化表型，而在动脉粥样硬化过程中内皮细胞产生的凋亡体中的miR-减少小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。另一方面，miR-a在心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞中高度表达，损害血管生成和血管重塑。
衰老是机体内多个器官和组织的进行性功能障碍，与许多疾病的风险增加相关，包括T2D和代谢综合征。营养感应失调和细胞间通讯改变是衰老的标志，反映了全身代谢稳态的功能障碍。一般来说，衰老的特征是miRNAs生物发生的下调。这发生在整个生物体的水平上和几种组织，包括脂肪组织、血液、肾脏、脑血管和干细胞，尽管一些研究报告了肝脏、大脑和血清中miRNAs的总体上调。部分miRNAs的表达差异与无脊椎动物和脊椎动物的寿命延长有因果关系。
研究表明，许多miRNAs在不同年龄的人血清、血浆和唾液样本的比较中丰度不同，然而，这些改变在反映环境影响、方法差异或研究个体中未诊断疾病的存在的研究中并未一致发现。尽管存在差异，但在多项研究中发现老年人循环中miR-、miR-21和miR-30c的增加。这些循环微小核糖核酸变化在衰老生物学中的确切作用仍不清楚，需要进一步探索。
miRNAs作为生物标志物，用于检测和预测与代谢相关的其他年龄相关疾病的预后，包括神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病以及癌症。表1列出了一些与神经退行性疾病可重复联系的miRNAs。
五、细胞外miRNAs是代谢稳态的管家
已知脂肪组织、免疫细胞、胰岛和许多其他与代谢疾病相关的细胞在肠道病毒和其他形式中都分泌大量的miRNAs。这些miRNAs反过来可以以旁分泌或自分泌的方式起作用，或者以内分泌的方式到达循环中起作用。表2列出了细胞外微小核糖核酸及其供体细胞、受体细胞、靶基因和脱氧核糖核酸关联。下面和图2总结了通过细胞外微小核糖核酸进行系统调节的最相关位点。
表2细胞外miRNA介导的细胞间关联
5.1脂肪组织
脂肪组织的功能除了以甘油三酯的形式储存能量外，还能分泌调控全身新陈代谢的分子来维持机体内环境平衡。这些分子包括脂肪产生的激素、信号脂质、炎症介质和EVsmiRNAs。ADicerKO小鼠约三分之二的循环miRNAs显著减少，这表明了脂肪组织对循环miRNAs库的显著贡献。患有各种脂肪营养不良的患者，其循环外泌体miRNAs也有显著改变。重要的是，脂肪组织分泌的miRNAs已经被证明可以到达肝脏和肌肉等器官，并调节该组织基因和蛋白质的表达。
脂肪来源的循环miRNAs有助于在内分泌方式中控制代谢稳态的一个例子是脂肪来源的miR-99b对肝脏FGF21的调控。ADicerKO小鼠在循环EVs中降低了miR-99b水平，肝脏中上调了FGF21mRNA和3UTR-报告基因的活性，这两种情况都可以通过将载有miR-99b的EVs注入循环中得到显著的纠正。与这一更为普遍的机制相一致，AdicerKO小鼠表现出广泛的表型，反映了其他组织的功能障碍，包括肌肉、β细胞和骨骼，以及系统性胰岛素抵抗。但哪些循环外泌体miRNAs可能参与这些其它表型仍有待确定。
其他研究表明，脂肪衍生EVs的miRNA可能也具有旁分泌功能。因此，含有miR-16、miR-27a、miR-b和miR-的大脂肪细胞释放的EVs可转移到小脂肪细胞中，刺激脂肪生成和脂肪细胞肥大。脂肪细胞分泌的miRNAs是由游离脂肪酸和H2O2诱导的，在老年小鼠的血清中这些miRNAs表达上调。这些结果提示促进脂质积累和胰岛素抵抗的信号可能通过脂肪细胞的分泌miRNAs从胰岛素抵抗的脂肪细胞向新形成的脂肪细胞传播。
microRNA的循环水平由脂肪组织分泌的与肥胖的病理生理学有关。同样,改善代谢功能障碍的减肥至少在某种程度上会引起循环microRNA的变化，肥胖个体在接受肥胖手术一年后，多种脂肪组织来源的循环miRNA发生了显著变化。这些miRNAs被预测为WNT-连环蛋白和胰岛素信号通路的靶成分。在减肥手术后表达差异的miRNAs中，let-7a和miR-16参与胰岛素受体信号转导的靶点，这些miRNAs的水平与支链氨基酸(BCAAs)水平相关，提示它们可能与系统性胰岛素抵抗有关。WNT/beta-catenin和TGF-β信号通路的调节也是肥胖和瘦人循环中miRNA表达差异的预测机制。例如，从肥胖供体脂肪细胞中分离出的EVs处理肝癌细胞后，TGF-β信号通路组分的基因表达发生了变化。鉴于此前有关TGF-β纤维化和非酒精性脂肪肝(NAFLD)的最新进展的报道，这些分泌的miRNAs可能作为脂肪组织-肝串扰机制，以应对代谢失调，并导致NAFLD。
这些脂肪来源的miRNAs可能是更复杂的调节循环的一部分。例如，TGF-β通过诱导成熟脂肪细胞中miR-b的分泌，进而将该miRNA转移到肌肉细胞中，从而降低PGC-1a的表达，从而控制肌肉的氧化代谢。骨骼肌也对miR-20b有反应，主要体现在miR-20b抑制胰岛素刺激导致糖原的积累并且在T2D病人的血清Evs中高表达。miR-27a存在于脂肪来源的EV中，并被肌肉细胞吸收，已被证明可以通过抑制PPARg诱导胰岛素抵抗。在人和小鼠中，血清miR-27a水平与肥胖和胰岛素抵抗呈正相关，提示miR-27a可能在细胞间通讯中发挥作用的miRNAs是肥胖相关胰岛素抵抗的另一个调节器。脂肪组织和肝脏的低级别炎症是肥胖和代谢综合征的共同特征。其特征是脂肪组织巨噬细胞向M1样表型极化，促炎细胞因子的产生增加。注射肥胖小鼠脂肪组织分泌的EVs后，小鼠的循环促炎细胞因子IL-6和TNF-a水平升高，并出现胰岛素抵抗。提出的机制包括单核细胞分化和巨噬细胞通过TLR4途径激活。这似乎部分受到miR-的控制，miR-可以靶向巨噬细胞中的SOCS1，从而促进STAT1，抑制STAT6信号，从而诱导m1样巨噬细胞极化。同样，当肥胖小鼠脂肪细胞分泌的EVs预处理骨髓源巨噬细胞时，这些巨噬细胞分泌抑制肌细胞或脂肪细胞胰岛素信号转导的分子。肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞可以诱导胰岛素抵抗。
肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞分泌的EVs中增加的miRNA中有miR-，这是一个下调PPARg的miRNA。在高脂饮食的小鼠中敲除miR-可以提高胰岛素敏感性，而这被野生型小鼠的骨髓移植所逆转。另一方面，另一组在喂食鼠粮的miR-敲除小鼠中发现糖耐量和胰岛素抵抗受损。此外，当脂肪细胞或脂肪前细胞暴露于脂多糖活化的巨噬细胞衍生的EVs时，在葡萄糖摄取或脂肪细胞分化方面没有观察到差异。同样，miR-在脂多糖激活的巨噬细胞分泌的EVs中也没有上调，这表明不同的促炎刺激(如肥胖与脂多糖)可导致EVs负载差异，进而可能对其靶组织产生不同的影响。
沿着这一思路，来自瘦小鼠的脂肪来源干细胞(ADSCs)分泌的EVs可导致巨噬细胞向抗炎M2样表型极化。同样，从瘦人身上获得的ADSC释放EVs中富集了miR-，与从肥胖人身上分离的ADSC释放EVs相比，这与这些小泡的促血管生成潜能有机制上的相关性。最后，内皮细胞分泌的EVs也可能参与脂肪组织的细胞间通讯和大分子交换，这一过程可以通过进食和禁食来调节。
综上所述，这些数据表明，脂肪组织中检测到的含有miRNAs的EVs可能来自脂肪垫内的不同细胞，并在不同刺激下受到不同的调控。同样地，一旦它们进入血液或血管外空间，它们就有能力作用于脂肪垫内的其他细胞或远处的组织，如肝脏、肌肉和造血细胞，以协调代谢稳态和能量平衡。因此，脂肪组织来源的miRNAs可能对代谢性疾病的病理生理学有广泛的贡献。
5.2胰腺
胰岛细胞不仅可以通过分泌胰岛素和胰高血糖素来控制代谢，还可以通过分泌miRNAs来控制代谢。研究表明，原代胰岛细胞和β细胞来源的MIN6细胞在收到胰岛素分泌刺激时可释放特定的miRNAs。例如，与瘦小对照相比，肥胖ob/ob小鼠的血清、胰岛、肝脏和骨骼肌中miR-增加。但其前体pri-miR-仅在胰岛中升高，这表明其他组织中成熟miR-水平升高来源于胰岛。关于miR-的潜在功能的研究有产生矛盾的结果；但是，miR-已被证明能与Glut4mRNA的3UTR结合，下调脂肪组织中的GLUT4(葡萄糖的代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，然而，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞对葡萄糖的摄入需要借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白)，同时促进心肌细胞中的GLUT4表达。
miR-、miR--3p和miR--5p可能从T淋巴细胞来源的EVs转移到β细胞，导致炎症通路的激活、细胞凋亡和胰岛素缺乏型糖尿病的发生。综上所述，这些研究表明胰岛可以与胰岛素共同分泌miRNAs，从而调节靶组织中的胰岛素作用，而外周细胞可以通过含有miRNAs的EVs将信号发送回胰岛。
5.3心血管系统
人单核细胞在促炎刺激后分泌的EVs具有高水平的miR-。用这些EVs孵育微血管内皮细胞可下调miR-靶基因c-Myb，这是一种参与内皮细胞迁移的转录因子。miR-在体外过表达可诱导内皮细胞迁移，这种作用可通过动脉粥样硬化患者（miR-水平上调）血浆中的EVs孵育来模拟。来自血管平滑肌细胞的EVs已被证明能够促进miR-向内皮细胞的转移，通过降低紧密连接蛋白的水平来影响内皮屏障的完整性。暴露于氧化的低密度脂蛋白（LDL）的内皮细胞分泌的EVs高表达miR-，miR-可以将巨噬细胞的极化从M2样表型转移到促炎性M1样表型。血清和心脏中miR-水平的变化被认为通过影响MCP-1和VCAM-1的表达而在心功能障碍中发挥作用。这些过程改变内皮功能，促进动脉粥样硬化。
5.4中枢神经系统
越来越多的证据表明，循环EVs可能穿过室管膜层和血脑屏障(BBB)作用于中枢神经系统，从而发挥组织间通讯的作用。老龄大鼠鼻腔给药含miR-的血清EVs可增加中枢神经系统的髓磷脂含量。改变血脑屏障通透性的神经退行性疾病可以促进大脑循环miRNAs与血液循环miRNAs的交换。也有证据表明EVs可以通过胞吞机制穿过血脑屏障。许多细胞外miRNAs被认为是神经退行性疾病的疾病生物标志物，尽管它们在这些疾病的病理生理学中的作用尚不确定。衰老会影响下丘脑干细胞分泌EVsmiRNAs，而脑室内注射下丘脑干细胞分泌产生的EVs能够延缓下丘脑衰老。含有miRNAs的EVs也涉及神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞之间的相互作用。年，Huang等人发现脑损伤后小胶质细胞EVs中miR-水平升高，miRNA可以转移到神经元中发挥抑制神经元炎症和促进神经元突触生长的作用。
图2在细胞间通讯中起作用的miRNAs
六、展望
6.1寻找细胞外miRNAs的来源与调控机制
尽管有越来越多的证据表明miRNAs参与细胞间或组织间的信息调控，但是不清楚miRNAs具体如何参与这些生理变化或疾病的病理变化；也不清楚为什么部分miRNAs优先装载到EVs或载体蛋白上分泌，而另一些被保留在细胞内；不同形式的miRNAs在半衰期、清除率或细胞摄取方面的差异。我们对这些机制在正常生理和病理中所起作用的了解程度还远远不够。
对于脂肪组织来说，作为循环miRNA库，是受各种生理刺激释放miRNAs的主要场所，运动也能够刺激含有miRNAs的EVs的释放，这些EVs可以作用于其他组织以增强代谢效应。虽然脂肪组织来源的miRNAs已被证明可以抑制远端组织(如肝脏)中的靶miRNAs，但这种组织间通信形式在生理和病理生理学中的完整作用仍有待阐明。
6.2确定细胞外miRNAs的靶标和功能
目前的研究主要集中在细胞外miRNA的靶选择性和作用机制，包括是否有优先的靶细胞、特定的传递机制等。但我们发现确定这些miRNAs是如何避免受体细胞降解并发挥功能也同样重要。有研究表明，部分miRNAs具有选择性传递的机制，其进入靶细胞能够促进基因沉默。miRNAs在循环中可以以不同的形式存在。此外，不同类型的细胞外颗粒可能被不同的细胞所吸收，这可能会影响进入的有效性以及哪些miRNAs将在宿主细胞中保持活性。研究显示，位于EVs膜和宿主细胞膜上的蛋白质被认为决定了宿主细胞的选择性和EVs摄取机制，尽管这一机制的细节以及在细胞间的存在的差异尚不清楚，但这决定EVs内容物的命运：是释放到细胞内小泡的细胞质中还是在溶酶体中降解。
6.3使用细胞外miRNA作为生物标记
虽然细胞外miRNAs作为疾病的生物标记物有很大的潜力，但其应用中重要的混淆因素是用于从体液中分离miRNAs的多种方法、识别其携带形式的局限性，以及最重要的是确定其来源。该领域约有一半的论文使用超离解法作为EVs分离的主要方法，但大多数研究在方案细节上存在差异，这可能对分离部分的最终性质很重要。第二种分离EVs的方法是通过加入像聚乙二醇这样的高分子拥挤试剂来分离EVs。虽然两种方法都会受到不同种类EVs以及脂蛋白和高分子量蛋白复合物的污染，但后一种方法的污染更严重。减少污染物的另一种方法是将分离方法与基于密度梯度的分选、尺寸排阻色谱、切向流过滤或磁珠靶向常见的外泌体标记，如四氟乙烯。虽然这些组合方法可能导致更纯的囊泡亚型，但它们需要更大的血容量、分析的miRNA的数量受限、大规模研究困难、只选择了一部分循环miRNAs、需要更具体的和标准化的方法隔离包含miRNAs的EVs或蛋白复合物以及需要根据他们的组织和技术来确定EVs的起源和其表面蛋白质模式，miRNAs通过不同的形式将提供更好的生物标志物和作为准确的诊断工具。
6.4细胞外miRNA在临床治疗中的应用
在治疗领域，使用含miRNAs的复合物有许多潜在的好处。考虑到使用这些复合物相对容易，特别是循环EVs，人们可以设想从健康的供体收集EVs，然后注射到病人体内治疗疾病(图3)。将临床相关的miRNAs模拟物或anti-miR分子装入患者自身的EVs中，再注入血液中，使EVs的miRNAs水平恢复正常。例如，含有高水平miR-b的ADSC来源EVs足以诱导血管生成，也是ADSC移植有利于改善几种心血管并发症的原因。miR-可以区分心脏干细胞来源的EVs和胚胎干细胞来源的EVs，后者部分由miR-介导，可促进心脏新生血管的增加、心脏功能的改善和心脏干细胞增殖的增加。
研究可通过较容易获取的组织，如脂肪组织，产生治疗性miRNAs，这些miRNAs在EVs中分泌，并在远处对组织起作用。由于脂肪组织可以有效地将miRNAs装载到EVs中，肝脏组织可以很好地吸收这些miRNAs，这可能提供一种新的方式来操纵这些靶组织中的基因表达，而无需直接在靶组织中引入基因修饰。这提示还有一个好处，就是如果在基因治疗中观察到任何不良反应，修饰后的脂肪组织可以被移除。
图3细胞外miRNA的治疗前景候选者在临床前研究中进行测试，并选择在疾病中起作用的miRNAs进行临床试验。临床相关的miRNA模拟物或抗miR分子被加载到病人自己的EVs中，并重新注入血液，以恢复EVmiRNA到正常水平。
七、总结
尽管这个领域还很年轻，细胞外miRNAs作为细胞间通讯的生理机制正在受到广泛的