作者及来源：
王涛左长京(审校者)程超(审校者)
肿瘤研究与临床,,27(11):-.
摘要
循环肿瘤细胞（CTC）已被证明可能是多种肿瘤转移的起源，在肿瘤转移复发及治疗抵抗中扮演着重要角色。通过富集检测CTC并分析其生物学特征，可以为肿瘤的早期诊断、转移风险及预后评估乃至个体化治疗方案的制定提供依据。文章主要就近年来关于CTC检测分析方法及临床应用进行综述。
正文
恶性肿瘤的高死亡率与其早期发现困难、易复发转移和药物抵抗密不可分，其中转移是导致肿瘤患者死亡的首要原因。肿瘤的侵袭与转移是早期事件，非传统上认为的晚期事件，而循环肿瘤细胞（CTC）正是这种"早期事件"的"当事人"。CTC已被证实在恶性肿瘤形成转移的一系列环节中扮演着重要角色，且与多种肿瘤的临床分期、无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）及抗肿瘤药物疗效等密切相关，是一种潜在的、实时的"液体活检"。对CTC及肿瘤转移分子机制的研究，不仅有助于阐明恶性肿瘤转移的机制，也有助于判断肿瘤预后，甚至对制定个体化治疗方案都至关重要。
1CTC概述年，澳大利亚学者Ashworth在1例因乳腺癌死亡患者的外周血中发现存在一种与原发肿瘤细胞类似的细胞，并首次提出了CTC的概念。现在认为的CTC是指由自发或诊疗操作等原因脱离了原发实体瘤或转移灶，侵袭并进入到外周循环血的肿瘤细胞。CTC一方面具有与原发肿瘤相似的抗原或（和）遗传特性，另一方面也显示出一些特殊性质（图1）。肿瘤转移理论认为，具有转移潜能的肿瘤细胞首先需要从原发灶脱离并进入血液或淋巴循环，然后方能在远处形成转移灶。研究发现上皮间质转变（EMT）使CTC表现出更强的变形及运动能力，从而担负起肿瘤转移的任务。EMT是指上皮细胞失去极性和黏附能力而具有游走迁移与侵袭的能力，表现出间质细胞样表型的一种生物学过程。脱离原发灶入血的CTC至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验，结果绝大多数在短期内死亡（如乳腺癌CTC半衰期只有1~2.4h），只有极少数（约0.01%）能转移到血液、淋巴或远处器官，而这些少量的CTC很难被检测到，所以也称为肿瘤的"微转移"。可见，若在外周血中检测到CTC，则提示可能存在着肿瘤的微转移。
图1循环肿瘤细胞和分子生物学特征
2CTC的富集与分析检测2.1CTC富集技术CTC富集技术依据其生理性质和物理性质或两者综合利用可分成3类（表1）。生理性质主要是利用CTC表面蛋白分子标志物来捕获CTC，又可分为阳性富集和阴性富集。新发实体瘤约有90％起源于上皮组织，因此上皮特异性标志物如上皮细胞黏附分子（EpCAM）就成为最常用的分子标志物，此外还有CK8、CK18、CK19等。CellSearch系统和微液流平台IsoFlux、CTC-Chip都是使用包被了EpCAM抗体的免疫磁珠来捕获CTC，其中CellSearch系统还是唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准可以用于临床检测转移性乳腺癌或前列腺癌患者CTC及预测PFS与OS的设备；AdnaTest系统则是利用同时包被了黏连蛋白和EpCAM抗体的混合磁珠来捕获CTC。为了克服体外血液体积限制，CellCollector将连接导管插入患者血管，30min内可以检测大约1.5L血液内CTC数量，并且患者没有发生不良反应，极大提高了检测效率。上述几种利用上皮源标志物来直接捕获CTC的方法即是阳性富集。
阴性富集主要利用CTC不表达而血细胞或血小板表达某些特异性分子来去除血细胞和血小板。如CTC一般不表达CD45分子，利用CD45抗体包被的免疫磁珠就可以去除白细胞，而CD61抗体包被的磁珠则可去除巨核细胞和血小板，MACS及EasySep系统即是利用了这一原理。除了生理性质，还可以利用CTC在大小、沉降系数、密度等方面与血细胞的差异来进行富集。多数CTC直径大于8μm，较正常血细胞大，可以通过过滤、离心等方式进行富集，如ISET系统使用8μm的聚碳酸酯膜可将大多数白细胞和CTC分离，富集度可达1个CTC/ml血。CTC-iCip系统则将CTC生理与物理性质结合起来，首先利用细胞大小将CTC与血细胞进行第一次分离，然后再利用阳性富集或阴性富集的方法进行第二次分离，提高了富集效率。
尽管新技术不断涌现，但CTC富集也面临着一些问题。如良性结肠疾病患者血中也可能出现上皮细胞，各种类型肿瘤中表达EpCAM抗原的仅占70%，也并非所有CTC直径都大于8μm；经过EMT后的上皮细胞特异性抗原表达水平大幅降低，导致阳性富集效率降低，且易出现假阴性。丝束蛋白3因在结直肠癌CTC经EMT后表达不下调，且在血细胞中不表达而成为一种新标记分子，但是否具有普遍应用性还有待研究。此外，研究者们还尝试用抗体"鸡尾酒"来富集CTC，即将各种亚型CTC表面标志物如EpCAM、N-钙黏连蛋白、波形蛋白、人表皮生长因子受体2（Her-2）、黏蛋白抗体混合物培养外周血细胞，再用生物素标记的二抗进行培养，与抗体结合的CTC即可被富集。"鸡尾酒"法的本意是尽量不放过一个CTC，但由于使用的抗体较多，正常血细胞可能会表达其中的至少某一种分子而导致出现假阳性。
2.2CTC分析技术CTC分析方法可分为细胞计数法、核酸检测法以及功能分析法等3种。细胞计数法主要包括免疫细胞化学技术（ICC）和流式细胞术（FCM）等；核酸检测法主要包括聚合酶链反应（PCR）和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）等。功能分析在体外主要是应用固相酶联免疫斑点技术（EPISPOT）来观察有活力的CTC特征；在体内，将有活力且具有肿瘤干细胞性质的CTC注射到免疫缺陷小鼠体内，形成移植瘤之后对瘤体进行分析（图2）。
图2循环肿瘤细胞的功能分析
ICC可以针对CTC特异的蛋白或基因进行原位检测，并对CTC的大小及形态学进行分析，但该技术检测到的细胞量少、敏感性低。FCM可以对体外CTC进行多参数、快速的定量分析和分选，从而获得细胞大小、内部颗粒形状、抗原以及DNA、RNA含量等信息；新兴的光声流式细胞技术（PAFC）则可高效、无创、实时动态监测体内CTC。核酸检测是目前最灵敏的技术，主要是以上皮源肿瘤细胞的mRNA为标志检测CTC。RT-PCR通过分析组织、肿瘤特异性标志物从分子水平检测CTC，其原理是以特异性mRNA为模板，先反转录成cDNA，再进行PCR扩增，以获得目的基因表达。因此，RT-PCR检测对CTC的完整性和活性没有要求，即使是CTC碎片也可以用于分析，这是其优势所在；但该法测定过程中需要破坏CTC，所以无法对CTC进行计数和形态学观察，而且，取样时的上皮细胞污染、假基因干扰等也容易造成假阳性结果。实时反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）则通过对外周血中表达的标志基因设置了截断值，只有高于该值才被认为是CTC的真实信号，在一定程度上可以减少假阳性的发生。此外，通过联合检测多种特异性基因表达有助于提高RT-PCR法检测CTC的特异性，但有可能造成假阴性。
功能分析法有助于观察活的CTC的生物学特征，特别是能发现肿瘤转移启动细胞（MIC）的特性。考虑到CTC在外周血中绝大多数处于凋亡状态，体外获取有活力的CTC显然更能代表体内发挥作用的CTC。以CD19作为上皮细胞标志物，利用EPISPOT技术，发现乳腺癌尚处于局部时，可以检出活CTC的患者其结局也更差；以PSA作为标志物，发现前列腺癌患者血中部分有活力的CTC可分泌成纤维细胞生长因子。体内功能分析则借鉴了异种移植的原理。将从乳腺癌患者外周血中获取的有活力的、分类的CTC注射到免疫缺陷小鼠体内，实验结束后收集肿瘤转移的器官并进行病理及免疫组织化学分析，发现CD44+、CD47+和MET+的CTC均具备MICs特征，且小鼠移植此类型CTC8个月后可出现骨转移；在预测疾病进展与生存结局方面，CD44+、CD47+、MET+的CTC较未分类CTC的相关性更高、更准确。
3CTC临床应用无论是肿瘤的早期筛查与扩散风险评估，还是转移瘤、难治性肿瘤的治疗方案选择及治疗抵抗机制研究，CTC检测都有其应用价值。
3.1CTC与肿瘤的早期诊断从理论上讲，自肿瘤形成之日起，就会有偶发的CTC存在。研究者通过标记追踪胰腺癌模型小鼠的胰腺上皮细胞，发现在病理手段能发现肿瘤之前，这些上皮细胞就已经出现在外周血中，并可以转移到肝脏，而这一系列行为与EMT使CTC具有间质样表型和肿瘤干细胞特性密不可分。由于如此稀少的CTC需要极为灵敏和特异的检测方法，肿瘤患者体内早期情况是否也是如此尚存争议，但研究者们相信绝大多数肿瘤患者体内早期已经存在CTC。以现有的高分辨率成像技术，能检测到的最小肿瘤灶所包含的肿瘤细胞实际上已经超过了1×个，试想若能利用CTC检测发现肿瘤，无疑相较于影像学手段将大大提前肿瘤的检出时间，但这一愿望的实现有待于CTC检测方法的提高。
3.2CTC与肿瘤的复发转移CTC的出现常意味着微转移的开始，在CTC达到一定数量后就可发生血行转移，从这个角度看，可认为CTC是肿瘤发生转移的必要条件。一项评价CTC检测在中国转移性乳腺癌中的应用价值的双盲、多中心大型临床研究中，研究者应用CellSearch系统发现健康人群CTC检出量为（0.05±0.26）个/7.5ml，良性乳腺病患者为（0.09±0.35）个/7.5ml，且两组人群CTC均≤2个/7.5ml；而在例转移性乳腺癌中，有例检出CTC≥5个/7.5ml，且CTC水平与肿瘤转移的部位、雌激素受体（ER）及Her-2状态相关。对乳腺癌、直肠癌和前列腺癌的共同研究中也发现所有健康志愿者CTC检出均小于2个/7.5ml，在转移性肿瘤患者中CTC检出≥2个/7.5ml者占到62.3%，而在局部肿瘤患者这一比例仅为14%；这意味着当上述3种肿瘤患者外周血中CTC检出≥2个/7.5ml时，出现转移的风险已经很大。通过CTC检测来判断肿瘤是否发生了转移，进而优化治疗措施，可以避免不必要的手术。但问题在于，对于不同的肿瘤，CTC究竟达到多少量才表示已经或可接受的"极大可能"发生了转移，尚无定论。
3.3CTC分子特征与个体化治疗抗肿瘤药物的靶向性与肿瘤患者出现药物抵抗是治疗共性与个性的体现，提示治疗还需因人而异，即个体化治疗。CTC检测可以揭示肿瘤细胞基因突变情况，并可提供其激素受体状态和干细胞特征等重要治疗标靶信息。变异的CTC常表现出不同于原发部位肿瘤细胞的一些特征，而传统上针对原发肿瘤研制的一些药物可能对CTC束手无策。Her-2和ER是乳腺癌治疗最常用的靶点，但研究发现Her-2阴性肿瘤患者外周血中也存在着Her-2阳性CTC，而ER阳性肿瘤患者外周血中也存在着ER阴性CTC。这意味着即使是Her-2阴性患者也可能从曲妥珠单抗等抗Her-2药物治疗中获益，而激素疗法可能对ER阳性患者体内的CTC无济于事。出现这种现象的根本原因在于CTC发生的基因突变。在结直肠癌，KRAS密码子12、13的突变可导致靶向EGFR抑制剂帕尼单抗作用大为减弱；对单个CTC分析显示KRAS存在着突变型和野生型，而KRAS突变型患者不可能从帕尼单抗的治疗中获益。肿瘤在患者身上发生的突变与其自身遗传特征、机体敏感性等诸多因素相关，必须因人而异，只有弄清发生了何种突变，才能真正做到个体化治疗，从这个角度看，CTC分析可以使治疗更趋合理。
3.4CTC与肿瘤预后评估CTC是多种肿瘤判断预后的敏感指标，也是影响肿瘤PFS和OS的独立危险因子。一项对52例胰腺癌患者的随访研究发现，术前检出CTC阳性患者的中位生存时间为(.00±31.93)d，低于阴性患者的(.00±69.60)d；手术前后CTC检出降低的患者中位生存时间为（.00±38.27）d，高于CTC检出升高患者的（.00±46.47）d；此外CTC检出率及数目还与胰腺癌分期呈正相关，即分期越高，CTC越多，预后也越差。已有大量研究表明转移性乳腺癌CTC的检测与临床预后关系密切，在一项纳入了例转移性乳腺癌患者的研究中，从化疗开始直到进展期CTC都没有升高的患者OS中位数为35个月；化疗开始时CTC升高，而21d后减少的患者OS中位数为23个月；化疗21d后CTC持续升高的患者OS中位数仅为13个月，3组间比较差异均有统计学意义。可见，通过监测治疗全程CTC的变化，不仅可预后评估，同时可为关键时间节点上采取措施提供依据，避免盲目治疗。
4结语肿瘤转移机制与风险评估、抗肿瘤治疗效果的实时监控、治疗靶标的确定及药物抵抗机制的阐明可谓是CTC研究的四大目标，实现这些目标的基础无疑依赖于CTC检测手段的进步，而缺乏更为特异的分子标志物已成为制约CTC富集与分析技术突破的瓶颈。在临床应用上，CTC既显示出巨大的潜力，也面临着诸多挑战。如CTC的检测费用昂贵，CTC与肿瘤相关事件的大规模、前瞻性、多中心临床随机试验研究尚不多，而且研究者之间使用方法不统一，尚难以形成具有临床诊断应用价值的共识或标准。但有理由相信，随着CTC相关研究的深入，今天所面临的每一个挑战最终都会加深我们对CTC的认识，也必定会为CTC检测更好地应用于临床铺平道路。
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