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特异性组织蛋白酶E激活的AIE探针：对胰腺癌术中进行病理荧光诊断
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今天给大家分享一篇华东理工大学朱为宏教授和王琪副教授团队合作发表在期刊AdvancedMaterials上的文献：AnEnzyme-ActivatableAggregation-Induced-EmissionProbe:IntraoperativePathologicalFluorescentDiagnosisofPancreaticCancerviaSpecificCathepsinE
摘要胰腺癌(PC)是最具破坏性的恶性肿瘤之一。然而，荧光探针用于PC的早期临床诊断，往往在准确性和穿透性方面遇到困难。本研究通过监测特异性过表达酶组织蛋白酶E(CTSE)，开发了一种用于PC高对比荧光诊断的QM-HSP-CPP。该探针由一个AIE荧光团QM-COOH(QM=喹啉-丙二腈)、CTSE触发的疏水肽(HSP)和亲水生物相容性细胞穿透肽(CPP)组成。CPP单元可以很好地调节分子分散特性，在水相生物系统中给予初始荧光关闭状态，从而具有较高的信噪比，最终克服了传统AIE探针较差的靶向选择性。CPP可以确保细胞/组织的穿透能力，从而允许现场监测PC细胞、组织和活的动物模型中的内源性CTSE。当QM-HSP-CPP探针被CTSE特异性切割时，可以原位产生具有高特异性和长期跟踪能力的AIE信号，并成功实现了人PC切片的术中诊断，在异位裸鼠模型中跟踪PC。CTSE-酶触发的AIEgens解放策略提高了准确性，同时解决了穿透问题，可以扩展大量生物相容性AIE活性探针的数据库，特别是用于建立术中病理荧光诊断。
设计方案传统的组织学苏木精和伊红(HE)和免疫组化(IHC)染色因为其固有复杂的操作方案耗时不能实现术中病理诊断，更不用说PC的体内跟踪(图1A)。尽管基于免疫荧光(IF)的技术促进了组织学某些方面的评估，但大多数商业染料会聚集引起猝灭(ACQ)的效应和较差的光稳定性使得荧光信号具有低信号/噪声(S/N)和较差的稳定性。此外，IF染料在生物组织上的非特异性附着可能会干扰肿瘤(T)组织和肿瘤旁组织(PT)组织之间的区别(图1A)。因此，开发一种有效的和早期的临床工具来实时和高特异性的原位诊断PC是非常紧迫性的。在这项工作中，利用喹啉-丙二腈(QM)，通过整合AIE核心QM-COOH、酶响应肽Ala-Pha-Per-Leg(简称HSP)，开发了一个AIE激活探针QM-HSP-CPP(图1B，C)。具体来说，基于AIEgen的QM核心克服了ACQ荧光团的固有缺陷，根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库，HSP提供了在PC中过表达的组织蛋白酶E(CTSE)的酶可切割反应位点(图1D)。此外，CPP的小亲水肽单元，保证了高效的细胞/组织穿透能力，并保证了理想的两亲性特性。
图1AIE激活探针QM-HSP-CPP，通过CTSE可视化PC的临床病理诊断
CPP单元的加入使亲水和亲脂系统都具有理想的荧光关闭状态对QM-HSP-CPP、QM-CPP和QM-HSP的所有光物理性质进行了评价(图2A-I)。QM-HSP在DMSO-water混合液中具有典型的AIE特征，它分散在DMSO中分散较好，信号较弱；而当含水量从40%到98%时，荧光强度迅速增强，最大发射在nm(图2A和2D)。因此，QM-HSP的水溶性较差，在背景信号较强的生物成像过程中会产生“始终亮”的荧光。QM-HSP-CPP在DMSO-water(图2B和2E)、乙醇(EtOH)-water(图2C和2F)的任何含水组分中的荧光信号都可以忽略不计，表明亲水CPP的整合可以有效地消除背景信号。AIE行为的内在性质是对分子内运动(RIM)的限制。因此，QM-HSP-CPP的AIE现象可以通过增加甘油(fg)的分数来限制分子的运动来证明。如图2G所示，QM-HSP-CPP在高粘度体系中的自由运动受到限制，从而释放出激发能作为辐射跃迁。具体来说，QM-HSP-CPP在fg=98%时的荧光强度是其初始强度的9倍，表明QM-HSP-CPP的经典AIE特征(图2H)。这样，CPP单元的加入可以在广泛的亲水亲脂环境中实现良好的分散状态，并在最小的背景下实现理想的AIE激活荧光。此外，基于QM的探针具有优异的光稳定性，这将支持生物成像中的长期跟踪能力(图2I)。
图2不同水组分(fw)条件下的QM-HSP和QM-HSP-CPP在不同溶剂中的AIE光谱分析
通过特异性CTSE激活原位生成AIE信号在没有CTSE的情况下，QM-HSP-CPP的荧光随着孵育时间的延长而保持关闭状态，说明探针在缓冲溶液中是稳定的(图3A和3E)。相反，当CTSE酶为50pmolmL-1时，QM-HSP-CPP的荧光强度随着孵育时间的延长而逐渐增加，直到12h达到最大值(图3B和3F)，说明该探针对CTSE酶具有特异性的响应。此外，用质谱法说明了CTSE对HSP的特异性响应机制，发现裂解产物在[M+2H]+/2=.(Calcd值.)和[M+2H]+/2=.(计算值为.)(图3I)。然后，以QM-HSP和QM-CPP作为参考探针进行酶反应试验，以验证QM-HSP-CPP对CTSE的特异性。如图3C和3G所示，QM-HSP的初始荧光强度较强，但随着孵育时间的延长，初始荧光强度略有下降，这可能与AIE聚集物的沉降有关。结果表明，探针QM-HSP不仅表现出较强的背景信号，而且与CTSE的关系不明确，不适合用于CTSE的测定。另一方面，探针QM-CPP保持了初始荧光关闭状态，而荧光强度随着孵育时间的变化几乎保持不变(图3D和3H)。结果表明，探针QM-CPP的背景信号较低，但对CTSE无响应。以上结果共同证实了，探针QM-HSP-CPP对CTSE具有特异性的反应，从而产生了AIE可激活的荧光信号。通过监测QM-HSP-CPP对多种潜在干扰物种的荧光响应，包括酶种类、生物分子和醋酸钠缓冲溶液(pH=4.0)中的无机盐，研究了其响应选择性。如图3J所示，探针QM-HSP-CPP在不同干扰物质孵育12h后，荧光变化可以忽略不计。相比之下，CTSE的荧光增强率为7倍，具有较高的选择性和生物应用前景。简而言之，探针QM-HSP-CPP可以对CTSE进行特异性响应，产生背景最小、响应最高的AIE荧光信号，这是后续生物成像所需的理想条件。
图3原位CTSE酶激活探针QM-HSP-CPP的AIE荧光信号
CPP保证了在PC细胞中现场监测内源性CTSE的高效细胞穿透能力将QM-HSP和QM-HSP-CPP与SW细胞孵育不同时间，以监测内源性CTSE(图4A)。图4B显示，QM-HSP由于其疏水性，主要聚集在细胞外，产生强烈的荧光，而细胞内几乎没有荧光，说明QM-HSP的细胞穿透能力较差，不能用于水生生物系统的功能检测。相反，随着孵育时间的延长，探针QM-HSP-CPP逐渐被CTSE裂解，并聚集产生AIE信号，这与细胞外光谱实验的结果一致(图3C)。归一化的细胞内强度(图4D)也表明QM-HSP-CPP具有良好的细胞穿透性和较高的S/N比。然后，将QM-HSP-CPP与正常细胞一起孵育，以验证其特异性。QM-HSP-CPP可以有效区分人PC细胞(SW)和正常的Islet内皮细胞(MS1)(图4E)，表明QM-HSP-CPP对CTSE的特异性靶向性。这些结果表明，将CPP单元集成到探针QM-HSP-CPP中，可以实现高效的细胞穿透能力，并原位生成高保真的AIE信号，用于长期跟踪人类PC细胞(SW)。
图4QM-HSP-CPP的高效细胞穿透能力和内源性CTSE的现场监测
PC切片的术中临床病理诊断前期实验证实了QM-HSP-CPP可以有效区分PC细胞和正常细胞，因此继续探索了QM-HSP-CPP探针对人人胰腺肿瘤组织和肿瘤旁组织的区分能力。首先，使用金标准的病理苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学(IHC)染色来区分肿瘤和肿瘤旁组织。如图5A所示，HE从形态上证实了胰腺导管腺癌(PDAC)和靠近癌症的正常组织。在这里，PDAC是由异常和不规则的导管结构组成，而肿瘤旁组织是由规则的胰腺腺泡组成。此外，SMAD4（胰腺癌低表达）和MUC5AC（胰腺癌高表达）的IHC染色进一步证实了HE染色的结果(图5A)。虽然HE和IHC染色可以提供PC切片的可靠病理信息，但操作复杂，体内应用有限。IHC显示，CTSE在肿瘤组织中表达阳性，而在正常组织中表达阴性，这与数据库统计数据一致。因此，CTSE的过表达可以用来区分肿瘤和肿瘤旁组织。然而，由于IF染料(AlexaFluor)不可控地附着在生物组织上，免疫荧光(IF)染色显示肿瘤和肿瘤旁组织之间没有显著差异(图5B)。而AIE活性探针QM-HSP-CPP在肿瘤组织中显示出明显的荧光信号，比肿瘤旁组织强9.3倍(图5B)，提示QM-HSP-CPP可用于PC的病理诊断。CLSM成像进一步证实了CTSE在PDAC细胞中的阳性表达(图5C)。3D图像显示了CTSE在肿瘤组织中的清晰分布深度(从3~7um)(图5D)，显示了由于CPP单元的整合，QM-HSP-CPP具有理想的深层组织穿透能力。结果表明，QM-HSP-CPP能够简单、快速、准确地实现术中病理诊断。
图5PC切片的术中临床病理诊断
内源性CTSE体内可视化接下来研究了QM-HSP-CPP在异位裸鼠模型中PC体内成像的能力。由于QM-HSP-CPP的最大发射量为nm，不适合在自动生物背景荧光干扰下进行体内成像，因此使用QM-HSP-CPP的尾发射量(nm)进行体内成像测试。将SW细胞移植到裸BALB/C小鼠右前臂周围，建立动物研究模型。瘤内注射和静脉注射的时间依赖性图像表明，探针QM-HSP-CPP可以靶向并照亮肿瘤组织。在肿瘤内注射QM-HSP-CPP4h后，由于内源性CTSE酶激活放大荧光信号，在肿瘤部位观察到显著的AIE信号(nm)(图6A)。信号在8h内保持相对不变，提示探针可以聚集在肿瘤组织中进行长期跟踪。此外，静脉注射结果证实，QM-HSP-CPP除了具有发光特性外，还具有理想的胰腺肿瘤靶向能力(图6B)，在荧光导航的临床操作中具有很大的潜力。注射8h牺牲小鼠后立即采集肿瘤和其他正常器官的体外荧光图像。与体内检测结果一致，荧光信号主要集中在肿瘤组织中（图6），进一步证实了QM-HSP-CPP的靶向性和体内实时性诊断能力。
图6NIR荧光追踪内源性CTSE
▉小结
本研究的重点是如何解决PC荧光探针的准确性和组织穿透性的瓶颈，以满足人类PC的靶向性跟踪和术中病理诊断。通过整合生物渗透单元CPP，开发了一个两亲性AIE活性探针QM-HSP-CPP，由QM-COOH支架报告AIE荧光，CTSE分裂肽HSP酶活性触发，和生物相容性CPP监管两亲性和渗透性。该探针具有良好的光稳定性，在非荧光的水溶液生物系统中具有良好的分散性，对过表达的CTSE酶具有较高的亲和力和选择性。CPP单元的集成探测器QM-HSP-CPP可以实现高效的细胞穿透能力和生成高保真AIE信号原位长期跟踪在人类PC细胞(SW)内过表达的CTSE酶。CTSE酶激活AIE探针QM-HSP-CPP成功实现了PC切片的术中病理诊断，弥补了传统病理分析方法的缺陷。
参考文献：
Zhu,Z.;Wang,Q.;Chen,X.;Wang,Q.;Yan,C.;Zhao,X.;Zhao,W.;Zhu,W.H.,AnEnzyme-ActivatableAggregation-Induced-EmissionProbe:IntraoperativePathologicalFluorescentDiagnosisofPancreaticCancerviaSpecificCathepsinE.AdvMater,e.
DOI:10./adma.07444扫码