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年9月6号，Science期刊online了颜宁和施一公两篇关于结构生物学研究类文章。这也是颜宁和施一公在年上半年刊发的第3和第4篇Science文章，文章的第一通讯地址同为清华大学。施、颜两人为清华大学在结构生物领域打了一张响亮的招牌，他们两个可以说是撑起了清华大学结构生物学半边天，为清华大学的结构生物立下了不可磨灭的功勋。施一公的博士生万蕊雪更是在博士期间，拿下9篇CNS，堪称“中国最牛博士生”。今天iNature就系统解读了年，颜宁和施一公两人7篇Science文章，以飨读者。
颜宁和施一公
1Science:与β1复合的人电压门控钠通道Nav1.4的结构
电压门控钠（Nav）通道的生理意义通过其控制膜兴奋性的主要功能得到强调。已经在与神经，心血管，肌肉和精神疾病相关的人类Nav通道中发现超过1,个点突变，例如癫痫，心律失常，肌肉麻痹，疼痛综合征和自闭症谱系障碍。Nav通道代表了各种天然毒素和临床治疗的主要目标。
在人类中，Nav通道有九种亚型，Nav1.1-Nav1.9。Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3和Nav1.6主要在中枢神经系统中起作用。Nav1.4和Nav1.5分别在骨骼肌和心脏中起作用。Nav1.7，Nav1.8和Nav1.9主要存在于周围神经系统中。离子传导核心亚基（α亚基）足以用于电压依赖性离子渗透，然而，膜运输和通道性质由四种亚型β1-β4中的一个或两个β亚基调节。
Nav通道属于电压门控离子通道（VGIC）超家族。与大多数同源四聚体的VGIC成员不同，真核生物Nav通道包含约2,个残基的单个多肽链，其折叠成四个同源但不相同的重复序列（重复I-IV）。每个重复包含六个跨膜区段S1-S6，其中S1-S4构成电压感应区域（VSD），来自四个重复的S5和S6一起包围孔结构域，S5和S6之间的序列形成细胞外结构域，选择性过滤器（SF）和SF支持螺旋P1和P2。与Cav和Kv通道相比，Nav通道具有高度不对称的SF。四个不同的残基，Asp/Glu/Lys/Ala（DEKA），在每个重复的SF的相应基因座处赋予Na+选择性。
Nav通道工作循环的简化模型包括静止，激活和非激活状态之间的转换。VSD响应膜电位变化而发生构象转变，导致孔结构域的打开和关闭。S4段上重复出现的碱性残基Arg/Lys代表“门控电荷”（GC）的分子基础，负责电压检测。在静息电位下，GC残基被吸引到细胞质侧并且孔结构域闭合。在膜去极化时，GC的向外移动通过称为机电耦合的过程导致孔隙打开。
激活后，Nav通道会立即快速失活，这是一种确保反复产生动作电位的关键机制。几十年的表征已经确定III-IV接头是快速失活的关键因素。在III-IV接头的N末端的疏水簇Ile/Phe/Met（IFM）被定义为快速失活基序。除了重复III和IV中S4-S5接头和S6区段的突变导致快速失活的动力学改变之外，对失活基序的结合位点的理解不太清楚。
了解Nav通道的生理和病理生理机制需要对多个功能状态的通道进行结构阐明。与其在现代生物物理学中的基础地位相比，真核生物Nav通道的结构研究落后于其他VGIC成员。
原清华大学颜宁研究组报告人类Nav1.4-β1复合物的冷冻EM结构，分辨率为3.2?。对孔结构域，电压感应域和β1亚基进行了精确的模型构建，深入了解了Na+渗透的分子基础和四个重复的动力学不对称性。报告的功能残基和疾病突变的结构分析证实了用于快速灭活Nav通道的变构阻断机制。该结构为Nav通道的机械研究和Nav通道病的药物发现提供了一条途径。
2Science:动物毒素调节电压门控钠通道的结构基础(点击阅读）
电压门控钠（Nav）通道在产生膜兴奋性方面起着关键作用，并且是许多化学杀虫剂和人类药物的靶标。Nav通道包含折叠成四个同源重复的一条单一多肽链（重复I-IV），每条重链包含六个称为S1-S6的跨膜螺旋。每次重复中的S1-S4区段构成电压感测区域（VSD），并且来自四个重复的S5，S6及其中间区段一起包围离子传导孔区域。
虽然小分子神经毒素如河豚毒素（TTX）和蛤蚌毒素（STX）起到孔隙阻滞剂的作用，但绝大多数肽类Nav通道毒素是门控修饰剂，通过与一个或多个相互作用，在通道周期的特定阶段捕获通道。与孔隙阻滞剂相反，门控调节剂毒素（GMTs）对Nav通道功能具有更复杂的变构效应，并且它们可以抑制或激活通道。GMT通常比孔阻滞剂具有更高的选择性，是开发亚型选择性Nav通道药物的有价值的线索。
尽管对GMT调节Nav通道功能的分子基础进行了广泛研究，但尚未出现这种相互作用的共识模型。早期研究表明细胞外S3-S4环在GMT结合中起主导作用，但随后的研究揭示了S1-S2环在许多GMT相互作用中的关键作用。最近的研究表明，GMTs位于S1-S4螺旋之间的面向细胞外的空腔中，使它们成为阻碍电压传感器运动的楔形物。有人提出，大的GMTs，如在蝎毒液中发现的那些，可能能够同时接触VSD和连接孔螺旋P2和孔区域中的S6区段的细胞外环，但迄今为止没有研究预测到任何孔结构域膜螺旋在GMT结合中的作用。
阻塞Nav通道孔隙的小分子在动物毒液中很少见，但TTX和STX是例外。顾名思义，TTX最初是以河豚（河豚）为例的tetrodontoid鱼中发现的。数千年前在中国，埃及以及后来的日本和墨西哥记录了由于消费含有TTX的鱼而导致的河豚中毒。随后显示TTX存在于致命的蓝环章鱼，青蛙和蝾螈的有毒分泌物以及掠食性月亮蜗牛的毒液中;这些动物不合成TTX，而是从内共生细菌中获取它。在20世纪中期发现，TTX的强效毒性是由于通过特异性抑制Na+流入抑制动作电位产生。STX是一种相关的胍鎓神经毒素，由海洋甲藻和蓝细菌产生，与TTX竞争结合Nav通道。
由于其对Nav通道的严格特异性，TTX和STX广泛用于Nav通道的药理学表征。哺乳动物Nav通道的九种亚型基于它们对TTX的易感性被分类为TTX抗性或TTX敏感性。后者受纳摩尔浓度的TTX抑制，而TTX抗性亚型Nav1.5，Nav1.8和Nav1.9仅响应微摩尔浓度的毒素。尽管在过去六十年进行了全面研究，但由于缺乏结构信息，大家对这些毒素作用机制的分子理解受到阻碍。已经阐明了几种细菌Nav通道的晶体结构，但这些同源四聚体原核生物直系同源物对TTX/STX不敏感，因为它们缺乏在其单链，不对称真核生物对应物中发现的受体位点。
原清华大学颜宁研究组，清华大学周强研究组及普林斯顿大学King合作，以3.8?的分辨率（34）阐明了美洲蟑螂美洲大蠊（Periplanetaamericana）的真核Nav通道NavPaS的结构。在这里，颜宁等研究组展示了该通道的2.8?分辨率cryo-EM结构与Dc1a的复合物，Dc1a是来自沙漠丛蜘蛛Diguetia的毒液的肽GMT，可以促进德国蟑螂通道打开Nav通道。颜宁等研究组还报告了NavPaS-Dc1a复合物在孔隙阻滞剂TTX和STX存在下的冷冻-EM结构，分别为2.6?和3.2?。观察到由三个羧酸酯基团构成的选择性过滤器（SF）中的Na+结合位点。该结构阐明了TTX/STX对孔隙阻滞的分子基础。
3Science:人类Patched1识别SonicHedgehog的结构基础（点击阅读）
在果蝇和脊椎动物中广泛研究的Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎发生和出生后组织维持和再生中起着关键作用。Hh信号的激活通过分泌蛋白Hh与Hh响应细胞中的膜包埋受体Patched（Ptch）结合来启动。在缺乏Hh的情况下，Ptch抑制Smoothened（Smo，F类GPCR），但机制尚不清楚。Hh与Ptch的结合减轻了Smo的抑制作用，并开启导致Hh通路转录激活的信号事件。受损的Hh途径活性可能导致出生缺陷，而通过抑制Ptch或激活Smo而异常活化Hh信号传导已牵涉到几种组织的肿瘤发生，例如基底细胞癌和成神经管细胞瘤。
在哺乳动物中，已经鉴定出三个Hh同系物，即Sonic（Shh），Desert（Dhh）和Indian（Ihh），其中Shh代表功能和机理解释的原型。约个残基的Shh前体经历自催化切割并产生?20kDa的氨基末端结构域（ShhN），其负责所有已知的信号传导活性。ShhN用N末端棕榈酰基和C末端胆固醇基部分修饰。尽管未分离的ShhN表现出降低的活性，但这些修饰对于与Ptch的高亲和力结合是不必要的。
由于Hh途径的异常激活与肿瘤发生相关，已经开发了靶向Hh信号传导的不同类型的抑制剂。虽然它们中的大多数是Smo的拮抗剂或Hh途径中下游组分的抑制剂，但一些（例如Robotnikinin和HL2-m5大环肽）被设计为破坏Ptch1和ShhN之间的相互作用。有关ShhN/Ptch1复合物的结构信息可能为设计或优化配体以破坏ShhN和Ptch1之间的复合物形成提供重要见解。虽然已经报道了许多单独的ShhN片段的晶体结构和与不同的结合蛋白复合的晶体结构，但没有关于Ptch的结构信息。
Patched（ptc）克隆为果蝇中的片段模式基因。后来人类同系物被确定为基底细胞痣综合征（也称为戈林综合征）的肿瘤抑制基因。在哺乳动物中存在两种Ptch同源物，Ptch1和Ptch2，尽管它们具有不同的表达模式和生理功能，但它们以相似的亲和力与三种类型的哺乳动物Hh配体结合。据预测，由个氨基酸组成的全长人Ptch1（hPtch1）含有12个跨膜片段（TM），两个胞外结构域（ECD）和两个胞内结构域。Ptch蛋白与质子驱动的多药耐药泵AcrB所示的细菌耐药结瘤分裂（RND）家族转运蛋白具有序列相似性。TMch2-6的Ptch构成固醇感受域（SSD），已经发现在许多固醇运输和代谢相关蛋白中，例如3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶（HMGCR），SREBP裂解活化蛋白质（SCAP），Niemann-Pick型C1（NPC1），NPC1样1（NPC1L1）和另一个Hh信号组件Disp。虽然人类NPC1的结构最近已被确定，但由含SSD的蛋白质介导的潜在固醇结合或运输的分子机制仍然是神秘的。
在这里，原清华大学颜宁研究组分别报告了人类Ptch1的和与ShhN复合物的整体分辨率分别为3.9?和3.6?的冷冻电镜结构。这些结构揭示了ShhN和Ptch1之间的详细认识。出乎意料的是，观察到两个类固醇分子，一个位于由ECD域包围的袋中，另一个位于SSD的面向膜的腔中。结构指导的生物化学分析表明ShhN和Ptch1之间的相互作用是类固醇依赖的，观察结果证实了额外的结构证据。
4Science：人源PKD1-PKD2复合物的结构
PKD1和PKD2基因的突变所导致的常染色体显性多囊肾病(ADPKD)，约占85%和10%，ADPKD是最常见的单基因疾病之一。然而，基因产物Polycystin-1和Polycystin-2(PC1和PC2，又称PKD1和PKD2)的生理和病理生理功能尚不清楚。
PKD1由个残基组成，可作为一种感受化学和机械力刺激的受体，而PKD2的同型四聚体结构符合典型的Ⅱ类瞬时受体电位(TRP)通道，被认为是内质网Ca2+释放通道，调节细胞内Ca2+浓度。据预测，这两种蛋白将以异种寡聚体的形式存在于肾上皮的初级纤毛上，尽管这种复合物形成的分子基础尚不清楚。
研究表明，PKD1和PKD2在结构中表现出1：3的比例。PKD1由电压门控离子通道（VGIC）折叠组成，其与PKD2相互作用以完成域交换的TRP结构。但是，有几个特征将PKD1与典型的TRP通道区分开来。PKD1的S6区段在中间被破坏，细胞外半部分S6a，类似于典型VGIC中的孔螺旋1（PH1）。S5和S6a之间的序列在EM图中是高度灵活和无序的。三个带正电荷的残基Arg，Arg和His向离子传导通路突出，很可能阻碍Ca2+离子的渗透性。因此，当前结构可能代表潜在的非导电状态。
离散折叠的结构域包含五个跨膜螺旋（TM）和胞质PLAT（Polycystin-1，脂氧合酶和α毒素）结构域，在PKD1中的VGIC折叠之前。PKD1的细胞外TOP结构域（其经常靶向ADPKD中的突变）偏离预期的对称位置15°，在细胞外TOP环中留下间隙。与PKD2亚基之间的同型相互作用相比，PKD1和PKD2之间的弱化界面提供了异四聚体中1：3化学计量的线索。复合物中较高比例的PKD1可能削弱TOP结构域的结合。
截短的PKD1-PKD2复合物的结构揭示了异寡聚体复合物的组装的分子机制，并为绘制和理解大量疾病突变提供了物理基础。阐明PKD1和PKD2的功能机制以及数百种ADPKD突变的疾病机制有待进一步研究。该结构作可为PKD1-PKD2和ADPKD的未来生物物理，生物化学，细胞和计算分析的框架。
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